Luận án Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở đàn gia cầm làm cơ sở cho phòng chống dịch bệnh tại Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN VĂN LÂM

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC

CỦA VIRUS CÚM A/H5 BIẾN CHỦNG MỚI Ở

ĐÀN GIA CẦM LÀM CƠ SỞ CHO PHÒNG

CHỐNG DỊCH BỆNH TẠI VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2021

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN VĂN LÂM

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC

CỦA VIRUS CÚM A/H5 BIẾN CHỦNG MỚI Ở

ĐÀN GIA CẦM LÀM CƠ SỞ CHO PHÒNG

CHỐNG DỊCH BỆNH TẠI VIỆT NAM

Ngành

: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

Mã số

: 9 64 01 02

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Tô Long Thành

2. PGS.TS. Chu Đức Thắng

HÀ NỘI - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Dữ liệu trong luận án là một phần của đề tài độc lập cấp quốc gia "Nghiên cứu sự

phân bố các biến chủng (clade) mới của virus cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt

Nam làm cơ sở cho việc phòng chống dịch bệnh đạt hiệu quả cao", mã số ĐTĐL.CN-

10/15, giai đoạn 2015-2018, do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương làm đơn vị chủ

trì đề tài.

Tôi xin cam đoan: (1) tất cả các kết quả thu được trong luận án này do tôi và

nhóm nghiên cứu thực hiện, kết quả được công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài

và các thành viên tham gia thực hiện; (2) các kết quả được trình bày trong luận án là

trung thực, khách quan và không trùng lặp với bất kỳ một luận án tiến sĩ nào đã công bố

trước đây; (3) mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tin

trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả luận án

Nguyễn Văn Lâm

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi nhận được sự giúp

đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám

đốc, Ban Quản lý Đào tạo, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều

kiện thuận lợi trong quá trình học tập, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp

đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS. Tô Long Thành, Trung tâm

Chẩn đoán Thú y Trung ương; PGS.TS. Chu Đức Thắng, Khoa Thú y, Học viện Nông

nghiệp Việt Nam, là những người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp đỡ tôi trong

quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.

Tôi xin cảm ơn tập thể các thầy cô và kỹ thuật viên thuộc Bộ môn Nội - Chẩn -

Dược - Độc chất, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo và các cán bộ của Trung tâm Chẩn đoán Thú

y Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu

của mình. Nghiên cứu này có sử dụng kinh phí của đề tài độc lập cấp quốc gia mã số

ĐTĐL.CN-10/15 "Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng (clade) mới của virus cúm

A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt Nam làm cơ sở cho việc phòng chống dịch bệnh đạt

hiệu quả cao", do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương làm đơn vị chủ trì đề tài.

Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn các thành viên trong cùng nhóm nghiên cứu,

các đồng tác giả Nguyễn Thị Thúy Mận, Nguyễn Hoàng Đăng, Nguyễn Đăng Thọ và

Tô Long Thành đã cho phép tôi sử dụng kết quả nghiên cứu đã công bố vào một phần

nội dung của luận án.

Nhân dịp hoàn thành luận án, tôi luôn biết ơn gia đình, đặc biệt là vợ tôi, đã luôn

bên cạnh, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu và bản luận án này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Văn Lâm

ii

MỤC LỤC

Lời cam đoan .................................................................................................................... i

Lời cảm ơn....................................................................................................................... ii

Mục lục ......................................................................................................................... iii

Danh mục chữ viết tắt..................................................................................................... vi

Danh mục bảng ............................................................................................................. viii

Danh mục hình................................................................................................................ ix

Trích yếu luận án ............................................................................................................ xi

Thesis abstract............................................................................................................... xiii

Phần 1. Mở đầu ...............................................................................................................1

1.1.

1.2.

1.3.

Tính cấp thiết của đề tài.....................................................................................1

Mục tiêu nghiên cứu ..........................................................................................2

Phạm vi nghiên cứu ...........................................................................................3

1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................3

1.3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu......................................................................3

1.4.

1.5.

Những đóng góp mới của luận án......................................................................3

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài...........................................................4

1.5.1. Ý nghĩa khoa học ...............................................................................................4

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................4

Phần 2. Tổng quan tài liệu .............................................................................................5

2.1.

Đại cương về bệnh cúm gia cầm........................................................................5

2.1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm .................................................................................5

2.1.2. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới................................................8

2.1.3. Tình hình dịch bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam...............................................11

2.1.4. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm.........................................................................14

2.1.5. Triệu chứng bệnh cúm gia cầm........................................................................16

2.1.6. Bệnh tích bệnh cúm gia cầm............................................................................17

2.1.7. Chẩn đoán bệnh cúm gia cầm..........................................................................19

2.2.

Virus học cúm gia cầm ....................................................................................21

2.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm type A.........................................21

2.2.2. Đặc tính kháng nguyên của virus cúm type A.................................................23

2.2.3. Thành phần hóa học của virus .........................................................................24

iii

2.2.4. Sự nhân lên và tác động gây bệnh của virus....................................................24

2.2.5. Độc lực của virus .............................................................................................27

2.2.6. Đặc tính các protein và khả năng biến chủng của virus...................................27

2.2.7. Sức đề kháng của virus ....................................................................................33

2.2.8. Nuôi cấy và lưu giữ virus.................................................................................33

2.2.9. Danh pháp........................................................................................................33

2.3.

Phòng chống bệnh cúm gia cầm ......................................................................33

2.3.1. Vacxin phòng bệnh cúm gia cầm.....................................................................33

2.3.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vacxin phòng bệnh cúm gia cầm................35

Phần 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu..........................................................38

3.1.

Nội dung nghiên cứu........................................................................................38

3.1.1. Giám sát để tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới ...........................................38

3.1.2. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới ...38

3.1.3. Nghiên cứu khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của

các loại vacxin .................................................................................................38

3.2.

Nguyên liệu nghiên cứu...................................................................................39

3.2.1. Dụng cụ lấy mẫu..............................................................................................39

3.2.2. Hóa chất lấy mẫu .............................................................................................39

3.2.3. Vacxin và động vật thí nghiệm........................................................................40

3.3.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................40

3.3.1. Phương pháp lấy mẫu ......................................................................................40

3.3.2. Phản ứng Realtime RT-PCR để sàng lọc, phát hiện virus cúm A/H5Nx ........42

3.3.3. Giám định virus phân lập bằng phương pháp HI.............................................45

3.3.4. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của virus A/H5 biến chủng mới............46

3.3.5. Phương pháp xác định chỉ số độc lực của virus A/H5 biến chủng mới...........47

3.3.6. Phương pháp đánh giá triệu chứng lâm sàng...................................................48

3.3.7. Phương pháp mổ khám toàn diện ....................................................................49

3.3.8. Chuẩn bị tiêu bản vi thể bằng phương pháp paraffin.......................................50

3.3.9. Phương pháp công cường độc kiểm tra hiệu lực phòng bệnh của vacxin

với virus cúm A/H5 biến chủng mới ...............................................................50

3.4.

Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................................52

iv

Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận...................................................................53

4.1.

Giám sát để tìm virus cúm A/H5 biến chủng mới ...........................................53

Kết quả thu thập mẫu và sàng lọc virus cúm A ...............................................53

Kết quả xác định subtype H5 từ các mẫu dương tính với virus cúm A...........55

Kết quả xác định subtype H5N1 từ mẫu dương tính với virus cúm A/H5 ......57

Kết quả xác định subtype H5N6 từ mẫu dương tính với virus cúm A/H5 ......60

Kết quả xét nghiệm virus cúm A/H5 biến chủng mới theo loài ......................62

Nghiên cứu phân loại virus cúm A/H5 biến chủng mới thu thập được từ

gà, vịt và chim cút............................................................................................63

Kết quả nghiên cứu nguồn gốc phát sinh của virus cúm A/H5 biến chủng

mới qua phân tích phả hệ dựa trên gen HA .....................................................65

Sự xuất hiện của virus cúm A/H5 biến chủng mới theo thời gian và

không gian .......................................................................................................70

Một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới.......................74

Đặc tính sinh học phân tử tiểu phần HA1 của các biến chủng........................74

Đặc tính gây bệnh của virus cúm A/H5 biến chủng mới.................................80

Triệu chứng bệnh tích do virus cúm A/H5 biến chủng mới gây ra trên

gia cầm.............................................................................................................82

Khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của các loại

vacxin...............................................................................................................90

Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.3.2.1c ......91

Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.3.4.4a ......96

Khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của virus clade 2.3.4.4b....101

Biến đổi bệnh lý ở gà có miễn dịch dị chủng sau công cường độc bằng

virus clade 2.3.4.4a và clade 2.3.4.4b............................................................106

Thảo luận về khả năng vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng của biến thể

virus cúm A/H5Nx.........................................................................................106

4.1.1.

4.1.2.

4.1.3.

4.1.4.

4.1.5.

4.1.6.

4.1.7.

4.1.8.

4.2.

4.2.1.

4.2.2.

4.2.3.

4.3.

4.3.1.

4.3.2.

4.3.3.

4.3.4.

4.3.5.

Phần 5. Kết luận và đề nghị .......................................................................................108

5.1.

5.2.

Kết luận..........................................................................................................108

Đề nghị...........................................................................................................109

Danh mục công trình đã công bố liên quan đến luận án...............................................110

Tài liệu tham khảo ........................................................................................................111

Phụ lục .......................................................................................................................128

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

ADN

AI

Diễn giải

Axit deoxyribonucleic

Avian influenza

ARN

ATSH

Bộ NN&PTNT

Bp

Axit ribonucleic

An toàn sinh học

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

Base pair

CEF

Chicken Embryo Fibroblast

Cúm gia cầm

CGC

CK

Chicken

CS

Cộng sự

CT

Cycle of threshold

CTCPTTYTW1

DK

Công ty Cổ phần thuốc Thú y Trung ương 1

Duck

ELISA

FAO

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Food and Agriculture Organization

Geometic Mean Titer

Goose

GMT

Gs

HA

Hemagglutination

HSD

Hạn sử dụng

HGKT

HI

Hiệu giá kháng thể

Hemagglutination Inhibition

Highly Pathgenic Avian Influenza

Intravenous Pathogenicity Index

Kilo base

HPAI

IVPI

Kb

LPAI

M

Low Pathogenic Avian Influenza

Matrix protein

MDCK

MDK

MDT

Madin-Darby-Canine-Kidney

Muscovy duck

Mediocris Downtime

vi

MEGA

NA

Molecular Evolution Genetic Analysis

Neuraminidae

NCVD

NEP

NP

National Centre for Veterinary Diagnostics

Nuclear export protein

Nucleoprotein

NS

Non-strutural protein

NSX

OIE

Ngày sản xuất

Office International des Épizooties

Polymerase acidic

PA

PB1

Polymerase basic protein 1

Polymerase basic protein 2

Phosphate Buffered Saline

Polymerase Chain Reaction

Specific pathogen free

Reverse transcriptase- Polymerase Chain Reaction

Ribonucleoprotein

PB2

PBS

PCR

SPF

RT-PCR

RNP

TCID50

TCN

TCVN

TW

Tissue Culture Infective Dosage

Tiêu chuẩn ngành

Tiêu chuẩn Việt Nam

Trung ương

VN

Việt Nam

WHO

World Health Organization

vii

DANH MỤC BẢNG

TT

Tên bảng

Trang

2.1. Sự xuất hiện của virus cúm A/H5 biến chủng mới giai đoạn 2003-2014.............7

2.2. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới giai đoạn 2004 - 2017.......................10

2.3. Bệnh tích điển hình của gà mắc cúm gia cầm.....................................................18

3.1. Cơ cấu thu thập mẫu của đề tài...........................................................................41

3.2. Danh mục các cặp mồi phát hiện gen M, H5, N1 và N6 ....................................43

3.3. Danh mục trình tự mồi giải trình tự gen HA1 và HA2.......................................44

3.4. Bố trí thí nghiệm công cường độc ......................................................................47

3.5. Bố trí thí nghiệm kiểm tra hiệu lực phòng bệnh của vacxin với virus H5N1

clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N6 clade 2.3.4.4b..............................51

4.1. Bệnh tích đại thể trên gà ở các lô thí nghiệm sau công cường độc.....................93

viii

DANH MỤC HÌNH

TT

Tên hình

Trang

2.1. Sơ đồ mô tả các cơ chế sinh bệnh chủ yếu, các gen và sản phẩm của gen

tham ra vào sự gây nhiễm của virus cúm A/H5N1.............................................15

2.2. Sơ đồ quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm....................................................21

2.3. Cấu trúc virus cúm H5N1 ...................................................................................22

2.4. Quá trình nhân lên của virus cúm .......................................................................25

2.5. Cấu trúc bậc 3 của HA virus cúm.......................................................................28

2.6. Vị trí của 5 epitope kháng nguyên chính ............................................................28

4.1. Kết quả sàng lọc virus cúm A tại các tỉnh giám sát............................................53

4.2. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A theo giai đoạn và khu vực giám sát............................54

4.3. Kết quả sàng lọc virus cúm A/H5 tại các tỉnh giám sát......................................55

4.4. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 theo giai đoạn và khu vực giám sát .....................56

4.5. Kết quả sàng lọc virus cúm A/H5N1 tại các tỉnh giám sát.................................58

4.6. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 theo giai đoạn và khu vực giám sát.................59

4.7. Kết quả sàng lọc virus cúm A/H5N6 tại các tỉnh giám sát.................................60

4.8. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N6 theo giai đoạn và khu vực giám sát.................61

4.9. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới theo loài .....................................62

4.10. Phả hệ của các chủng virus cúm H5 trong nghiên cứu và các chủng virus

thuộc các clade khác nhau đã lưu hành ở Việt Nam...........................................66

4.11. Phả hệ của các chủng virus cúm H5 trong clade 2.3.4.4 ....................................67

4.12. Phả hệ của các chủng virus cúm H5 trong clade 2.3.2.1 ....................................68

4.13. Sự phân bố không gian của virus cúm gia cầm 1/2015 tới 6/2016.....................71

4.14. Sự phân bố không gian của virus cúm gia cầm 7/2016 tới 6/2017.....................72

4.15. Sự phân bố không gian của virus cúm gia cầm 7/2017 tới 3/2018.....................73

4.16. Trình tự amino acid gần vị trí cắt của protein HA..............................................74

4.17. Trình tự amino acid ở hốc gắn thụ thể tế bào vật chủ.........................................75

4.18. Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.2.3.1c.......................76

4.19. Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.3.4.4b ......................77

4.20. Trình tự amino acid vùng kháng nguyên A-E của clade 2.3.4.4a.......................78

4.21. Đặc điểm hiện tượng glycosyl hóa ở tiểu phần HA1..........................................79

ix

4.22. Tỷ lệ gà chết theo thời gian khi gây nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới

qua tĩnh mạch......................................................................................................80

4.23. Chỉ số độc lực của virus và thời gian chết trung bình của gà khi gây nhiễm

virus cúm A/H5 biến chủng mới.........................................................................82

4.24. Điểm lâm sàng của gà gây nhiểm với virus cúm A/H5 biến chủng mới ............82

4.25. Bệnh tích đại thể của gà được gây bệnh thực nghiệm với virus cúm A/H5

biến chủng mới ...................................................................................................86

4.26. Bệnh tích vi thể của gà được gây bệnh thực nghiệm với virus cúm A/H5

biến chủng mới (HE 10x) ...................................................................................88

4.27. Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch trong thí nghiệm công cường độc bằng

virus clade 2.3.2.1c .............................................................................................91

4.28. Khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.2.1c ở gà có đáp ứng miễn

dịch dị chủng.......................................................................................................92

4.29. Bệnh tích đại thể ở gà có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau khi công cường

độc bằng chủng virus clade 2.3.2.1c...................................................................94

4.30. Hiện tượng thải virus ở gà có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau công cường

độc bằng chủng virus clade 2.3.2.1c...................................................................95

4.31. Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch cho gà và vịt trong thí nghiệm công cường

độc bằng virus clade 2.3.4.4a..............................................................................96

4.32. Khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.4.4a ở gà và vịt có đáp ứng

miễn dịch dị chủng..............................................................................................97

4.33. Hiện tượng thải virus ở gà và vịt có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau công

cường độc bằng chủng virus clade 2.3.4.4a........................................................99

4.34. Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch cho gà và vịt trong thí nghiệm công cường

độc bằng virus clade 2.3.4.4b ...........................................................................101

4.35. Khả năng gây bệnh của chủng virus clade 2.3.4.4b ở gà và vịt có đáp ứng

miễn dịch dị chủng...........................................................................................103

4.36. Hiện tượng thải virus ở gà và vịt có đáp ứng miễn dịch dị chủng sau công

cường độc bằng chủng virus clade 2.3.4.4b......................................................105

x

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Nguyễn Văn Lâm

Tên luận án: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới

ở đàn gia cầm làm cơ sở cho phòng chống dịch bệnh tại Việt Nam.

Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Mã số: 9.64.01.02

Xác định được có hay không sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở

đàn gia cầm tại Việt Nam; từ đó xác định một số đặc tính sinh học của biến chủng nhằm

khuyến cáo sử dụng vacxin phòng bệnh.

Phương pháp nghiên cứu

Ba nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) kỹ

thuật PCR dùng để phát hiện virus cúm A/H5 biến chủng mới trong mẫu bệnh

phẩm và giải trình tự gen virus; (ii) ứng dụng tin sinh học, với các phần mềm như

MEGA, Weblogo, S.A.S, v.v... để phân tích đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm

A/H5 biến chủng mới; (iii) bố trí thí nghiệm để đánh giá độc lực, triệu chứng bệnh tích

trên gia cầm và khả năng bảo hộ của vacxin với virus cúm A/H5 biến chủng mới.

Kết quả chính và kết luận

Có 3 nhóm kết quả đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm:

1) Đã xác định được có sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở 11 tỉnh

(Hà Nội, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế,

Kon Tum, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang) tại Việt Nam trong giai đoạn 2015-2018,

cụ thể:

Virus CGC lưu hành có tỷ lệ dương tính với virus: cúm A (gen M) 9,15%; A/H5

1,15 %; A/H5N1 0,23%; A/H5N6 0,65%;

Virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được gồm: A/H5N6 subclade

2.3.4.4a/b phân bố ở miền Bắc và miền Trung; A/H5N1 clade 2.3.2.1c chủ yếu ở miền

Nam; chưa phát hiện virus cúm A/H5N6 ở miền Nam;

Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5 biến chủng mới cao nhất trên vịt (A/H5N1 0,42%,

A/H5N6 1,27%), tiếp đến là gà (A/H5N1 0,23%, A/H5N6 0,5%), chưa phát hiện biến

chủng mới trên chim cút.

xi

2) Xác định được một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới

Virus cúm A/H5 biến chủng mới thuộc H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 clade 2.3.4.4a

và 2.3.4.4b có độc lực cao với chỉ số IVPI tương ứng 2,95, 2,78 và 2,87.

Virus cúm A/H5 biến chủng mới mang đặc điểm khác biệt về trình tự amino acid

trên gen HA so với các chủng virus vacxin (Navet-vifluvac, Re-5) được phép hiện hành

ở Việt Nam;

Các virus cúm A/H5 biến chủng mới đặc hiệu với receptor của gia cầm, gây bệnh trên

gia cầm với các biểu hiện đặc trưng của bệnh CGC gồm: (1) triệu chứng lâm sàng như sốt

cao, ủ rũ, mệt mỏi, chảy nước mắt, nước mũi, thở khò khè; (2) biến đổi bệnh tích gồm phù,

sung huyết, xuất huyết và hoại tử ở hầu hết các cơ quan phủ tạng.

3) Đánh giá được khả năng bảo hộ đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới của

các loại vacxin hiện hành.

Đáp ứng miễn dịch dị chủng từ vacxin Navet-vifluvac và Re-5 đối với các biến

chủng virus mới (clade 2.3.2.1c; clade 2.3.4.4a; clade 2.3.4.4b): (1) tạo được miễn dịch

trên ngưỡng bảo hộ (>4log2); (2) không tạo ra trạng thái miễn dịch vô trùng, (3) có khả

năng bảo hộ lâm sàng 50- 80% gà và 100% vịt thí nghiệm;

Gà được gây miễn dịch dị chủng từ Navet-vifluvac và Re-5 có xu hướng giảm bài

thải virus cường độc, giảm rõ rệt biến đổi bệnh tích đại thể (chỉ có bệnh tích: ở phổi với

Navet-vifluvac; ở phổi, gan, cơ và ruột với Re-5);

Virus H5N6 clade 2.3.4.4b vượt qua đáp ứng miễn dịch dị chủng tốt hơn virus

H5N6 clade 2.3.4.4a và H5N1 clade 2.3.2.1c;

Vacxin Navet-vifluvac bảo hộ lâm sàng cho gà (70-80%) chống lại virus cúm

A/H5 biến chủng mới tốt hơn vacxin Re-5 (50-70%).

xii

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Nguyen Van Lam

Thesis title: Investigation into biological characteristics of novel avian influenza A/H5

variants circulating on poultry as a basis for disease prevention in Vietnam.

Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals

Code: 9.64.01.02

Educational organization Institution: Vietnam National University of Agriculture.

Research Objectives The goal of research

To identify if there were novel avian influenza A/H5 variants circulating on

poultry in Vietnam and their biological characteristics as fundamental guideline for

vaccines selection.

Materials and Methods

Three main methods groups were adopted in this study, including: (i) Polymerase

chain reaction (PCR) was used to detect and gene sequencing of avian influenza A/H5

virus. (ii) Bioinformatics programs including MEGA, Weblogo, S.A.S, etc. to analyze

molecular biological characteristics of influenza virus A/H5 new strains. (iii)

Experimentally infected chickens with the obtained virus strains to evaluate their

virulence and protection ability of some commercial vaccines against the new strains.

Main findings and conclusions

Three milestones were achieved in this study:

1) New strains of influenza A/H5 virus had been identified in 11 provinces

(Hanoi, Phu Tho, Thai Nguyen, Nghe An, Quang Nam, Quang Ngai, Thua Thien Hue,

Kon Tum, Dong Thap, Vinh. Long, Kien Giang) of Vietnam over the period from 2015

to 2018:

The isolated avian influenza virus were identified to be positive with (M gene),

A/H5, A/H5N1, A/H5N1 at the proportion of 9.15%; 1.15%; 0.23% and 0.65%,

respectively.

The isolated influenza A/H5 virus were A/H5N6 clade 2.3.4.4a/b circulated in the

North and Central, meanwhile the A/H5N1 clade 2.3.2.1c circulated mainly in the

South. However, the A/H5N6 influenza virus was not found in the South.

xiii

The prevalence of A/H5 influenza virus new strains was highest in ducks

(A/H5N1 0.42%, A/H5N6 1.27%), and lower rate in the chickens (A/H5N1 0.23%,

A/H5N6 0, 5%), meanwhile it was not detected in quail.

2) Findings on biological characteristics of influenza virus A/H5 new strain:

The isolated A/H5 virus influenza new strain belongs to H5N1 clade 2.3.2.1c,

H5N6 clade 2.3.4.4a, and 2.3.4.4b whose virulence with IVPI index of 2.95, 2.78, and

2.87 respectively.

The new variant influenza A/H5 virus has different characteristics in the amino

acid sequence of the HA gene compared with the vaccine strains (Navet-vifluvac, Re-5).

The new avian variant of influenza A/H5 viruses were specific pathogenesis on poultry,

experimentally infected chickens manifested with specific symptoms and lesions,

including: (1) high fever, moodiness, fatigue, eyes and nasal discharged, and wheezing;

(2) Gross lesions including edema, congestion, hemorrhage, degeneration, necrosis, and

inflammatory cell infiltrates in most of the internal organs.

3) Findings on the evaluation of effect of commercial vaccines against the

influenza virus A/H5 new strains:

Heterologous immunity responses from Navet-vifluvac and Re-5 vaccines with

variants new virus (clade 2.3.2.1c; clade 2.3.4.4a; clade 2.3.4.4b): (1) yielded immunity

above the protective threshold (> 4log2); (2) does not create a sterile immune state; (3)

clinically protected experimental poultry against A / H5 virus (20-50% in chickens and

100% ducks).

Chickens vaccinated with Navet-vifluvac and Re-5 reduced excretion of virulent

virus and markedly decreased macroscopic lesions (only lung lesions were found in

chickens vaccinated with Navet-vifluvac; meanwhile lesion in liver, muscle, and

intestines were found in animals injected with Re-5);

H5N6 clade virus 2.3.4.4b was able to overcome the heterologous immune

response better the H5N6 clade 2.3.4.4a and the H5N1 clade 2.3.2.1c virus;

Navet-vifluvac vaccine protected 70 to 80% of experimental chickens against

influenza virus A/H5 new strain meanwhile Re-5 vaccine only obtained 50-70%.

xiv

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh cúm gia cầm (CGC) là bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra trên gia

cầm, do virus subtype A/H5 gây ra. Bệnh CGC xảy ra lần đầu tiên ở Việt Nam

vào cuối năm 2003 và được ghi nhận là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao

(HPAI) gây nên. Virus CGC HPAI A/H5N1 lần đầu tiên phân lập được từ ngỗng

ở Guangdong Trung Quốc năm 1996 (Xu & cs., 1999), xâm nhập vào Việt Nam

cuối năm 2003, từ đó đến nay bệnh xảy ra liên tục và đang là vấn đề dịch tễ phức

tạp do xuất hiện nhiều phân dòng virus mới, là dịch bệnh cần phải giải quyết tại

nước ta (Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2008; Lê Thanh Hòa & cs., 2008).

Virus cúm A/H5N1 từ khi xuất hiện tại Việt Nam năm 2003 cho đến năm

2005, gây bệnh CGC ở tất cả các tỉnh thành trên cả nước chủ yếu do biến chủng

virus clade 1 (Wan & cs., 2008; Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2008), bên cạnh đó

clade 2.3.2 cũng được phát hiện năm 2005. Năm 2006, tình hình dịch CGC tạm

lắng do các biện pháp làm giảm nguồn bệnh được áp dụng như cấm ấp nở thủy

cầm (loài mang trùng virus CGC) và tiêm phòng vacxin trên phạm vi cả nước cho

gia cầm bằng vacxin Re-1 (clade 0). Từ năm 2007 đến giữa năm 2010, có sự khác

biệt địa lý về lưu hành của các biến chủng virus CGC, các clade 2.3.4 dòng Phúc

Kiến (sau đó phân chia thành các subclade 2.3.4.1, 2.3.4.2, 2.3.4.3) chiếm ưu thế ở

các tỉnh phía Bắc. Trong khi đó, các clade 1 và subclade 1.1 (tiến hóa từ clade 1)

lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam, sau đó tiếp tục tiến hóa thành clade 1.1.1 và

1.1.2 (Nguyễn Tiến Dũng & cs., 2008; Nguyen & cs., 2012). Trong thời gian này,

vacxin Re-1 và Re-5 (clade 2.3.4) nhập khẩu từ Trung Quốc đã được sử dụng,

đồng thời một vacxin trong nước dùng chủng NIBRG-14 (clade 1) được thử

nghiệm. Năm 2008, clade 7 được phát hiện trên gia cầm nhập lậu ở Lạng Sơn và

một số chợ ở Hà Nội. Năm 2010-2011, nhiều biến chủng mới đã nổi lên, clade

2.3.2.1 (xuất hiện cuối 2009) trở nên thịnh hành vào cuối năm 2010 và tiến hóa

thành các clade 2.3.2.1a,b (Nguyen & cs., 2012) lưu hành ở các tỉnh phía Bắc, các

clade 1.1.1 và 1.1.2 tiếp tục lưu hành ở các tỉnh phía Nam.

Giữa năm 2012 clade 2.3.2.1c xuất hiện ở miền Bắc, sau đó nhanh chóng lây

lan vào miền Trung và miền Nam Việt Nam, đồng thời các clade 2.3.2.1a và b dần

biến mất. Năm 2013, chỉ còn clade 2.3.2.1c lưu hành trên cả nước và clade 1.1.2

vẫn khu trú ở các tỉnh phía Nam. Đầu năm 2014, các clade 2.3.2.1c và 1.1.2 vẫn là

những clade chính gây bệnh CGC ở Việt Nam, tuy nhiên sau tháng 2 năm 2014,

1

clade 1.1.2 không còn được phát hiện. Từ tháng 4 năm 2014, dịch CGC do

subclade 2.3.4.4 gây ra bắt đầu xuất hiện ở miền Bắc như Lạng Sơn (tháng

4/2014), Lào Cai (8/2014), Phú Thọ (9/2014). Sau đó, virus đã nhanh chóng được

phát hiện ở một số tỉnh miền Trung như Hà Tĩnh (6/2014), Quảng Ngãi (8/2014),

Quảng Trị (8/2014) (Nguyễn Đăng Thọ & cs., 2016).

Virus CGC không có hoạt động sửa lỗi trong quá trình tổng hợp ARN khi

nhân lên, làm biến đổi gen hình thành những biến chủng mới. Khả năng biến đổi

gen đã giúp virus cúm tiến hóa rất đa dạng, dẫn đến những đợt dịch CGC mới xuất

hiện. Tuy nhiên, những thay đổi kháng nguyên còn xảy ra do sự tái tổ hợp gen giữa

các virus cúm khác nhau để tạo ra một biến chủng virus mới có độc lực không thể

lường trước và tiềm ẩn gây ra các đại dịch (Van den Berg & cs., 2008). Khả năng

tái kết hợp gen của các virus cúm cùng subtype hay khác subtype đã tạo ra nhiều

virus cúm tái tổ hợp mới có kiểu gen khác nhau. Các nghiên cứu trước đây đã xác

định được virus cúm H5N1 dòng GS/GD/96 đã tiến hóa thành 10 clade khác biệt

về di truyền (0-9) và rất nhiều các subclade khác (WHO/OIE/FAO, 2008).

Từ thực tế cho thấy, sự xuất hiện liên tục các biến chủng mới của virus

A/H5N1 qua các năm đã làm phức tạp thêm vấn đề sử dụng vacxin trong phòng

chống bệnh CGC, thậm chí làm cho vacxin mất hẳn tính hiệu quả. Vì vậy, việc

xác định có hay không sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở Việt

Nam, xác định một số đặc tính sinh học và thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh

của các loại vacxin hiện hành với biến chủng mới là rất cấp thiết, mang tính

khoa học và thực tiễn.

Kết quả nghiên cứu của luận án là một phần nội dung của đề tài độc lập

cấp quốc gia mã số ĐTĐL.CN-10/15 "Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng

(clade) mới của virus cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt Nam làm cơ sở cho

việc phòng chống dịch bệnh đạt hiệu quả cao", do Trung tâm Chẩn đoán Thú y

Trung ương làm đơn vị chủ trì, đề tài đã được nghiệm thu năm 2018.

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1.2.1. Mục tiêu tổng quát

Trả lời câu hỏi có hay không sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng

mới ở đàn gia cầm tại Việt Nam; từ đó xác định một số đặc tính sinh học của

biến chủng nhằm khuyến cáo sử dụng vacxin phòng bệnh.

1.2.2. Mục tiêu cụ thể

- Xác định được sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở đàn gia

2

cầm tại Việt Nam;

- Xác định được đặc điểm phân tử gen và độc lực của virus cúm A/H5 biến

chủng mới;

- Đánh giá được hiệu quả phòng bệnh của một số vacxin cúm gia cầm hiện

hành đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới.

1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

1.3.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là virus cúm A/H5 biến chủng mới ở đàn

gia cầm tại Việt Nam.

1.3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu được thực hiện ở miền Bắc, miền Trung và miền

Nam, trong đó:

+ Mẫu dịch hầu họng được thu thập trên gia cầm từ các ổ dịch, chợ và trại

chăn nuôi gia cầm tại 11 tỉnh (Hà Nội, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An,

Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Đồng Tháp, Vĩnh

Long, Kiên Giang) thuộc 3 miền trên cả nước.

+ Các xét nghiệm và phân tích chuyên sâu thực hiện tại Trung tâm Chẩn

đoán Thú y Trung ương.

+ Các thí nghiệm động vật được thực hiện tại khu nuôi động vật an toàn

sinh học của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.

- Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 11/2015 đến tháng 8/2018.

1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đã xác định có sự lưu hành của virus cúm A/H5 biến chủng mới ở 11 tỉnh

(Hà Nội, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên

Huế, Kon Tum, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang) thuộc 3 miền tại Việt Nam

trong giai đoạn 2015-2018 gồm: A/H5N6 subclade 2.3.4.4a/b và A/H5N1 clade

2.3.2.1c.

- Đã xác định được đặc điểm phân tử gen, độc lực và khả năng gây bệnh của

virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được;

- Đánh giá được khả năng bảo hộ dị chủng của vacxin Navet-vifluvac và Re-5

đối với virus cúm A/H5 biến chủng mới phân lập được.

3

1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1. Ý nghĩa khoa học

- Hiểu biết hơn về sự lưu hành của virus CGC tại các địa phương nghiên cứu.

Làm cơ sở tham khảo cho nghiên cứu tiếp theo về sự biến đổi của virus CGC.

- Làm rõ hơn về một số đặc tính sinh học của virus CGC như: đặc điểm

phân tử gene, độc lực và khả năng gây bệnh trên gia cầm.

- Khuyến cáo lựa chọn vacxin phù hợp với virus A/H5 biến chủng mới

xuất hiện trên đàn gia cầm tại Việt Nam.

1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn

- Xác định được sự lưu hành của virus CGC ở 11 tỉnh (Hà Nội, Phú Thọ,

Thái Nguyên, Nghệ An, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Thừa Thiên Huế, Kon

Tum, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Kiên Giang) thuộc 3 miền tại Việt Nam trong

giai đoạn 2015-2018 gồm: A/H5N6 subclade 2.3.4.4a/b phân bố ở miền Bắc và

miền Trung; A/H5N1 clade 2.3.2.1c chủ yếu ở miền Nam; chưa phát hiện virus

cúm A/H5N6 ở miền Nam.

- Xác định được đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5 biến chủng mới

(H5N1 clade 2.3.2.1c, H5N6 subclade 2.3.4.4a và 2.3.4.4b), bao gồm: (1) là virus

thể độc lực cao; (2) mang đặc điểm khác biệt về trình tự gen so với các chủng

virus vacxin (Navet-vifluvac, Re-5) được phép hiện hành ở Việt Nam; (3) đặc

hiệu với receptor của gia cầm, gây triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh tích

trên gia cầm mang đặc trưng của bệnh CGC.

- Đáp ứng miễn dịch dị chủng từ vacxin Navet-vifluvac và Re-5 với các

biến chủng (clade 2.3.2.1c; clade 2.3.4.4a; clade 2.3.4.4b): (1) không tạo ra trạng

thái miễn dịch vô trùng; (2) làm giảm bài thải virus cường độc; (3) bảo hộ về lâm

sàng hoàn toàn ở vịt, 50 – 80% ở gà.

4