Luận án Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
HOÀNG THỊ GIANG
TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG
BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI
VÀ KHOAI TÂY TRỒNG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
HOÀNG THỊ GIANG
TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC
SƢƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA
KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG
Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62 62 01 11
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Nguyễn Quang Thạch
2. TS. Ramona Thieme
HÀ NỘI – 2016
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ
lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn,
các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày… tháng… năm…
Tác giả luận án
Hoàng Thị Giang
i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự
hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng
nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Quang Thạch – Viện Sinh học Nông nghiệp – Học Viện
Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian, tâm
huyết và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Ramona Thieme, TS. Thilo
Hammann – Viện Nghiên cứu Chọn tạo Giống Cây trồng (Viện JKI)- CHLB Đức, là
những ngƣời thầy đã tận tình luôn tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian và công sức
và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Di truyền và Chọn giống cây trồng, Khoa Nông học- Học viện Nông nghiệp Việt
Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Sinh học Nông
nghiệp, đặc biệt là các cán bộ Phòng Sinh học phân tử & Công nghệ vi sinh đã giúp đỡ và
tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./.
Hà Nội, ngày... tháng... năm 20...
Nghiên cứu sinh
Hoàng Thị Giang
ii
MỤC LỤC
Lời cam đoan
i
ii
Lời cảm ơn
Mục lục
iii
vi
vii
ix
xi
xiii
1
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Trích yếu luận án
Thesis abstract
PHẦN 1 MỞ ĐẦU
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
Tính cấp thiết của đề tài
1
Mục tiêu của đề tài
Phạm vi nghiên cứu
3
3
Những đóng góp mới của đề tài
3
Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
4
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
5
2.1
Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam
5
2.2
Nguồn gen khoai tây dại và tình hình khai khác nguồn gen khoai tây dại
Vai trò của nguồn gen kháng bệnh trên cây khoai tây
Tình hình khai thác nguồn gen kháng bệnh trong chọn tạo giống khoai tây
Cơ sở khoa học của phƣơng pháp dung hợp tế bào trần
Tách tế bào trần
7
2.2.1
2.2.2
2.3
7
8
10
10
11
12
13
14
15
15
17
18
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.4
Nuôi cấy tế bào trần
Tái sinh tế bào trần
Dung hợp tế bào trần
Chọn lọc các con lai soma
Bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây
2.4.1
2.4.2
2.4.3
Giới thiệu về bệnh mốc sƣơng
Đặc điểm xâm nhiễm của nấm P. infestans
Cơ sở phân tử của tính kháng bệnh mốc sƣơng do nấm P. infestans gây ra
iii
2.4.4
2.5
Các nghiên cứu về gen kháng bệnh mốc sƣơng trên cây khoai tây
Các phƣơng pháp chọn tạo giống khoai tây
20
23
23
23
24
30
30
30
30
30
30
31
32
32
2.5.1
2.5.2
2.5.3
Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp truyền thống
Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp chuyển gen
Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần
PHẦN 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1
3.1.2
3.2
Địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.3
Vật liệu thực vật
Hóa chất
Thiết bị
Nội dung nghiên cứu
3.3.1
Nội dung 1: Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại
với các giống khoai tây trồng
32
33
33
3.3.2
3.3.3
3.3.4
Nội dung 2: Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp xác định
độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR
Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai
soma và các đặc tính nông sinh học
Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng
để tạo quần thể chọn lọc
34
34
3.4
Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1
Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống
khoai tây trồng
34
38
39
3.4.2
3.4.3
3.4.4
3.5
Xác định con lai soma bằng đo độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị
phân tử SSR
Đánh giá tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây
nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử
Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần
thể chọn lọc
43
44
Phƣơng pháp xử lý số liệu
iv
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
45
45
4.1
Kết quả
4.1.1
Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống
khoai tây trồng
45
4.1.2
Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây
trồng thu thập đƣợc
48
51
4.1.3
4.1.4
Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp
Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đo độ bội (Flow
cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR
Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây
nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử
Nghiên cứu tạo con lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai
tây trồng
55
58
4.1.5
4.1.6
4.2
73
84
Thảo luận
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
91
5.1
5.2
Kết luận
91
Kiến nghị
92
Danh mục các công trình công bố
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
93
94
104
v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BA
: 6-benzyl amino purine
: Backcross
BC
CNSH
CT
: Công nghệ sinh học
: Công thức
CV
: Coefficient of variation
: Double Antibody Sandwich –
Enzyme linked imunosorbent assay
: Deoxyribonucleic acid
: Enzyme – linked imunosorbent assay
: Food and Agriculture Organization
: Gibberellic Acid
DAS – ELISA
DNA
ELISA
FAO
GA3
IAA
: Indole-3-acetic acid
JKI
: Julius Kuehn Institute
: Khối lƣợng củ trung bình
: Least significant difference
: Murashige and Skoog
: Naphthaleneacetic acid
: Năng suất lý thuyết
KLCTB
LSD
MS
NAA
NSLT
NSTT
: Năng suất thực thu
OD
: Optical density
PCR
PEG
PVX
PVY
RAPD
SAS
SH
: Polymerase chain reaction
: Polyethylene glycol
: Potato virus X
: Potato virus Y
: Random Amplified Polymorphic DNA
: Statistical Analysis Systems
: Somatic hybrid
SSR
Tm
: Simple sequence repeat
: Nhiệt độ gắn mồi
UV
: Ultra violet
vi
DANH MỤC BẢNG
TT
Tên bảng
Trang
vii
viii
DANH MỤC HÌNH
TT
Tên hình
Trang
ix
x
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Tên tác giả: Hoàng Thị Giang
Tên Luận án: Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sƣơng bằng dung hợp tế bào trần
giữa khoai tây dại và khoai tây trồng
Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Mã số: 62 62 01 11
Tạo đƣợc các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại
nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sƣơng từ
loài dại vào khoai tây trồng, sau đó lai trở lại (backcross) với khoai tây trồng nhằm tạo
đƣợc nguồn vật liệu di truyền khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng.
Phƣơng pháp nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu: Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sƣơng (Solanum
bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế
tại Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK,
Genebank); các giống khoai tây trồng mang các tính trạng nông sinh học quý thích nghi
với điều kiện khí hậu ở Việt Nam
- Nội dung và phương pháp nghiên cứu: (1) Tách và dung hợp tế bào trần giữa
các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng theo Morller et al. (1992) và đƣợc
cải tiến bởi Thieme et al. (1997, 2008); (2) xác định các con lai soma bằng các phƣơng
pháp đo độ bội (Flow cytometry) theo (Thieme et al., 2008) và bằng chỉ thị phân tử SSR
(theo Dinu and Thieme, 2001; Song et al., 2005); (3) đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc
sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo (theo Darsow et al., 2004;
Hammann et al., 2009) và bằng chỉ thị phân tử (theo Wang et al., 2008 và Lokossou et
al., 2010); (4) lai trở lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần
thể chọn lọc
Kết quả chính
- Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại
mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch
enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung
dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông
xi
số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế
bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trƣờng nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi
trƣờng VKMII lỏng; môi trƣờng Cul-medium để tạo callus và môi trƣờng RJM để tái
sinh chồi.
- Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội (2x)
mang gen kháng bệnh mốc sƣơng (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với
giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.). Các con lai soma của tổ hợp lai giữa
dòng khoai tây dại S. bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4,
2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn
vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây
kháng bệnh của Việt Nam.
- Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo đƣợc 11
tổ hợp lai và chọn đƣợc 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat
(13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng
đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu có giá trị cho
chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nƣớc ta.
xii
THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Hoang Thi Giang
Thesis title: Study of interspecific somatic hybrids between wild potato species and
potato cultivars via protoplast fusion for selection of late blight resistant potato
Major: Genetics and Plant Breeding
Code: 62 62 01 11
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
The aims of this study was to produce interspecific somatic hybrids and then to
investigate the possibilities to incorporate late blight resistance from diploid wild potato
species into tetraploid potato cultivars. These hybrids and progenies could be promising
materials for breeding program of late blight resistant potato in Vietnam.
Materials and Methods
- Material: Late blight resistant wild-type potatoes (Solanum bulbocastanum, S.
tarnii, S. Pinnatisectum) that come from the Leibniz Institute of Plant Genetics and
Crop Plant Research, IPK, Genebank, Germany); cultivated potatoes with promising
agronomical traits in Vietnamese condition.
- Methods: Protoplast fusion was conducted between late blight resistant wild-
type potates (S. bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum) and potato cultivars
(Solanum tuberosum L.). In the present study, protocols for protoplast isolation, fusion,
and culture according to Morller and Wenzel (1992) and modified by Thieme et al.
(1997, 2008) were used to obtain interspecific somatic hybrids. Flow cytometry (Dinu
and Thieme, 2001) and single sequence repeat methods (Song Ye-Su et al., 2005) were
ultilized to identify all the regenerated plants and selected interspecific somatic hybrids
which were hexaploid (2n=6x=72). These interspecific somatic hybrids were assessed
continuously resistance to late blight via detached leaflet assay, tuber slice test and field
test (Darsow et al., 2004; Hammann et al., 2009) and molecular markers to find the
presence of resistant genes Rpi-blb (Wang et al., 2008, Lokossou et al., 2010). In
addition, backcrossing (backcross-BC) between the somatic hybrids and the cultivated
potato varieties as the pollen donor to generate the BC1 progeny were conducted in the
present study.
xiii
Main findings and conclusions
In the present study 1612 calluses from seven different fusion combinations
were generated, of which 188 progeny plants were regenerated. Flow cytometry (Dinu
and Thieme, 2001) and single sequence repeat methods (Song Ye-Su et al., 2005) were
ultilized to identify all the regenerated plants and selected 69 interspecific somatic
hybrids which were hexaploid (2n=6x=72). These interspecific somatic hybrids were
assessed continuously resistance to late blight via detached leaflet assay, tuber slice test
and molecular markers to find the presence of resistant genes Rpi-blb. Only somatic
hybrid plants between S. bulbocastanum with Delikat exhibited resistance against late
blight disease. Futhermore, Rpi-blb1 and Rpi-blb3 genes, which belong to resistant-
related genes, Rpi-blb, were found in somatic hybrids of these combination. Moreover,
these BC1 also exposed many precious agronomical characteristics of cultivated
potatoes. These hybrids and progenies could be promising materials for breeding
program of late blight resistant potato in Vietnam.
xiv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Khoai tây là một trong bốn cây lƣơng thực quan trọng của loài ngƣời.
Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, khoai tây bị nhiều tác nhân gây bệnh
tấn công, ảnh hƣởng đáng kể tới năng suất. Trong các bệnh gây hại khoai tây,
bệnh mốc sƣơng do Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây ra đƣợc coi là
bệnh phổ biến và nguy hại nhất. Trong điều kiện thuận lợi bệnh có thể phát triển
nhanh thành dịch, phá hủy toàn bộ mùa màng trong vòng một đến hai tuần lễ.
Nhiều biện pháp đã đƣợc xây dựng và đề xuất để hạn chế tác hại của bệnh mốc
sƣơng nhƣ sử dụng giống kháng bệnh và đặc biệt sử dụng các loại thuốc hoá học
phòng chống bệnh mốc sƣơng. Trung tâm Khoai tây quốc tế (CIP) ƣớc lƣợng
hàng năm Mỹ, châu Âu và các nƣớc đang pháp triển phải chi khoảng 1 tỉ đôla cho
thuốc hóa học để kiểm soát bệnh mốc sƣơng (Anonymous, 1997). Việc sử dụng
biện pháp phòng chống bệnh hại bằng thuốc hóa học vừa gây ô nhiễm môi trƣờng
vừa tăng chi phí sản xuất (Darsow et al., 2008) nhƣng vẫn không giảm thiệt hại
hoàn toàn. Hơn nữa, nấm mốc sƣơng có tính di truyền khá linh động và thích ứng
cao nên dễ kháng các loại thuốc hóa học. Chọn giống kháng bệnh mốc sƣơng đƣợc
coi là một biện pháp hiệu quả, đặc biệt sau dịch bệnh mốc sƣơng gây ra nạn đói ở
Ái-nhĩ-lan giữa thế kỷ 19 (1845-1846) và các dịch bệnh xảy ra vào nửa đầu thế kỷ
20 ở châu Âu.
Chọn giống khoai tây kháng bệnh vào đầu thế kỷ 20 (những năm 1950 và
1960) tập trung vào việc sử dụng các gen trội (R còn gọi là gen Rpi) chính kháng
mốc sƣơng từ loài hoang dại Solanum demissum và 11 gen R đƣợc chuyển vào
khoai tây. Mặc dù gen kháng chính có hiệu quả cao, nhƣng tính kháng ở các
giống mang gen kháng chính R nhanh chóng bị vƣợt qua vì nấm mốc sƣơng có
khả năng thích nghi với cây kháng rất nhanh (Fry, 2008; McDonald and Linde,
2002). Tuy nhiên, nhiều chiến lƣợc khác nhau đƣợc xem xét để sử dụng các gen
kháng nhằm tạo khả năng kháng đồng ruộng bền vững (Jones, 2001; Park et al.,
2009) và sử dụng các gen kháng từ nhiều loài hoang dại khác nhau. Các gen
kháng từ các nguồn khác nhau đƣợc tích tụ nhờ phƣơng pháp lai chuyển gen
truyền thống và sử dụng chị thị phân tử (Tan et al., 2008, 2010).
Các nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài khoai tây dại nhƣ Solanum
pinnatisectum (pnt2G), Solanum tarnii (trn3G), Solanum bulbocastanum (blb2G)
1
(Thieme et al., 2008; Szczerbakowa et al., 2005), Solanum cardiophyllum
(Thieme et al., 2010) mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng cao. Tuy nhiên,
rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua con đƣờng lai hữu tính giữa các loài
hoang dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do cơ chế cách ly về
sinh sản (Jackson and Hanneman, 1999), cụ thể là sự khác biệt về số lƣợng
nhiễm sắc thể và số cân bằng nội nhũ (Borgato et al., 2007; Tiwari et al,, 2010).
Để khắc phục rào cản lai này nhà chọn giống có thể sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc
thể, lai bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin và cứu phôi. Dung hợp tế bào trần
để tạo con lai, gọi là con lai soma, là một giải pháp để khắc phục rào cản lai xa
(Oberwalder et al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) và chuyển nhiều gen
kháng vào khoai tây trồng. Dung hợp tế bào trần hay lai soma có thể chuyển các
tính trạng đơn gen và đa gen từ các loài hoang dại vào khoai tây nhƣng vẫn bảo
toàn đƣợc hệ gen nhân và tế bào chất (Gavrilenko et al., 2003) và tạo ra nguồn
vật liệu đa dạng mang mức kháng bệnh cao (Mattheij et al., 1992; Thach et al.,
1993; Davey et al., 2005; Thieme et al., 2010).
Các nhà nghiên cứu đã thu nhận đƣợc nhiều con lai soma kháng mốc
sƣơng giữa khoai tây trồng với S. circaeifolium (Mattheij et al., 1992), S.
pinnatisectum (Thieme et al., 1997), S. bulbocastunum (Helgeson et al., 1998), S.
nigrum (Horsma et al., 2001), S. berthaultii (Bidani et al., 2007), S. tarnii
(Thieme et al., 2008) và S. cardiophyllum (Thieme et al., 2010). Một số con lai
soma giữa khoai tây với S. bulbocastunum (Helgeson et al., 1998), S. nigrum
(Horsman et al., 2001), S. tarnii (Thieme et al., 2004, 2008) đã đƣợc lai lại với
khoai tây trồng tạo vật liệu tiền chọn giống để khai thác trong các chƣơng trình
chọn giống.
Mặc dù quy trình lai soma ở thực vật, kể cả khoai tây đã đƣợc thiết lập,
phƣơng pháp phân lập tế bào trần và tái sinh cây đối với các loài hoang dại từ
Mexico chƣa đạt hiệu quả cao (Chen et al., 2006). Chen et al. (2006) cho rằng để
ứng dụng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần hai tiêu chí phải thỏa mãn, đó là phải
phân lập đƣợc số lƣợng tế bào trần đủ lớn và chúng có khả năng nhân và tái sinh
thành cây mới. Nhìn chung, tế bào trần có thể phân lập dễ dàng từ mô lá thông qua
xử lý emzym. Song các điều kiện phân lập phụ thuộc vào kiểu gen, thay đổi mạnh
giữa các loài do sự khác nhau về thành phần của thành tế bào. Davis (1985) chỉ ra
rằng các điều kiện khác nhau ảnh hƣởng tới năng suất và khả năng tái sinh của tế
bào trần, do đó cần phải xác định pháp và điều kiện cụ thể cho từng loài.
2
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập tế bào trần từ ba loài
khoai tây hoang dại S. pinnatisectum, S. tarnii và S. bulbocastanum (pnt2G,
trn3G và blb2G) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và dung hợp với tế bào trần từ
các giống khoai tây trồng tứ bội Delikat, Atlantic, Agave và Rasant, mẫn cảm với
bệnh mốc sƣơng.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Xác định đƣợc các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào
trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sƣơng và các giống
khoai tây trồng mẫn cảm với bệnh mốc sƣơng.
Tạo đƣợc các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai
tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh
mốc sƣơng từ loài dại vào khoai tây trồng.
Tạo đƣợc các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống
khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo đƣợc dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen
kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây
kháng bệnh mốc sƣơng ở Việt Nam.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Trên cơ sở thu thập đƣợc nguồn vật liệu quý là các dòng khoai tây dại
mang nguồn gen kháng bệnh mốc sƣơng, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình
tách, dung hợp tạo các thể lai soma cải thiện đƣợc khả năng kháng bệnh mốc
sƣơng đồng thời tổ hợp đƣợc những tính trạng quý từ khoai tây trồng. Trên nền
đa dạng di truyền đã tạo ra, đánh giá, chọn lọc các thể lai soma có khả năng
kháng bệnh mốc sƣơng và mang các đặc tính nông sinh học phù hợp.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đã xác định đƣợc các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại
mang gen kháng bệnh mốc sƣơng và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch
enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong
dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung
hợp ở thông số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung
điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trƣờng nuôi cấy các sản
phẩm sau dung hợp là môi trƣờng VKMII lỏng; môi trƣờng Cul-medium để tạo
callus và môi trƣờng RJM để tái sinh chồi.
Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội
3
(2x) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S.
tarnii) với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) tứ bội (4x) mẫn cảm
với bệnh mốc sƣơng (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta và Rasant) nhƣng có năng
suất và chất lƣợng tốt. Các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây dại S.
bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 và
2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sƣơng Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật liệu
kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chƣơng trình chọn tạo giống khoai tây kháng
bệnh của Việt Nam.
Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo
đƣợc 11 tổ hợp lai và chọn đƣợc 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5
x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh
mốc sƣơng đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật
liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nƣớc ta.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đây là một nghiên cứu có tính khoa học chuyên sâu về di truyền chọn
giống cây trồng. Đề tài cũng là một bƣớc phát triển kỹ thuật cao của công nghệ tế
bào thực vật (kỹ thuật dung hợp tế bào trần) trong tạo giống khoai tây. Các kết
quả của đề tài có giá trị khoa học cả trong nƣớc và quốc tế. Đề tài đã góp phần
chứng minh khả năng chuyển đƣợc tính kháng bệnh mốc sƣơng từ các loài khoai
tây dại sang các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần và ứng
dụng thành công kết quả này trong chọn tạo các giống khoai tây trồng kháng các
loại bệnh quan trọng.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu đã chọn tạo đƣợc thành công 4 dòng con lai soma và khoai tây
trồng giống Delikat (blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat là các dòng 13.1303.2,
13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11 có khả năng kháng bệnh mốc sƣơng đồng
thời có đặc điểm nông sinh học phù hợp. Đây là nguồn vật liệu có giá trị cho
chƣơng trình chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sƣơng ở Việt Nam.
4
Tải về để xem bản đầy đủ
147 trang
20240
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- luan_an_tao_the_lai_mang_gen_khang_benh_moc_suong_bang_dung.pdf
- DT&CGCT - TTLA - Hoang Thi Giang.pdf
TTT - Hoang Thi Giang.doc- TTT - Hoang Thi Giang.pdf
