Luận án Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo các dòng đậu tương kháng bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi Sydow)
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
NGUYỄN VĂN KHỞI
ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN TẠO
CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT
(Phakopsora pachyrhizi Sydow)
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP – 2018
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
NGUYỄN VĂN KHỞI
ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN TẠO
CÁC DÒNG ĐẬU TƯƠNG KHÁNG BỆNH GỈ SẮT
(Phakopsora pachyrhizi Sydow)
Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số:
9 62 01 11
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Phan Hữu Tôn
TS. Nguyễn Thanh Tuấn
HÀ NỘI – 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng sử dụng bảo vệ
để lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày....... tháng.......năm 2018
Tác giả luận án
Nguyễn Văn Khởi
i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận
đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn
bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới GS.TS. Phan Hữu Tôn và TS. Nguyễn Thanh Tuấn đã tận tình hƣớng dẫn,
dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu hoàn thành luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,
Bộ môn Di truyền và chọn giống cây trồng, Khoa Nông học – Học viện Nông nghiệp
Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành
luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo Viện Cây lƣơng thực và Cây thực
phẩm, các đồng nghiệp thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Cây lƣơng thực và
Cây thực phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện các thí
nghiệm của luận án.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ
và động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án.
Tác giả luận án
Nguyễn Văn Khởi
ii
iv
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ
ADN
Axit desoxiribonucleic
AFLP
Amplified Fragments Length Polymorphism
(Đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)
Area Under Disease Progess Curve
AUDPC
(Chỉ số nhiễm bệnh tích lũy theo thời gian)
BNN&PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
bp
Base pair (Cặp nucleotide)
cM
Centi Morgarn (Đơn vị chiều dài bản đồ di truyền)
Cetyltrimethylammonium bromide
CTAB
CTP
dNTPs
Đ/c
Cây thực phẩm
Deoxynucleotide Triphosphates
Đối chứng
FAO
Food and Agriculte Organization of the United Nations
(Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc)
Marker Assisted Backcrossing (Lai lại nhờ chỉ thị phân tử)
Marker Assisted Selection (Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử)
Nhiễm sắc thể
MABC
MAS
NST
KL
Khối lƣợng
KKN
PCR
Khảo kiểm nghiệm
Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
Tiêu chuẩn ngành
TCN
TGST
RAPD
Thời gian sinh trƣởng
Random Amplified Polymophic DNA
(Đa hình các đoạn ADN khuếch đại ngẫu nhiên)
Restriction Fragment Length Polymorphism
(Đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn)
Single Nucleotide Polymorphism (Đa hình các Nucleotide đơn)
Simple Sequence Repeats (Những trình tự lặp lại đơn giản)
Sequence Tagged Site (Vị trí trình tự đƣợc đánh dấu)
World Vegetable Research Development Center
(Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau màu thế giới)
RFLP
SNP
SSR
STS
WVRDC
vi
viii
ix
TRÍCH YẾU CỦA LUẬN ÁN
Tên tác giả: Nguyễn Văn Khởi
Tên Luận án: Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo các dòng đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt
(Phakopsora pachyrhizi Sydow)
Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Mã số: 9 62 01 11
Phát hiện đƣợc mẫu giống đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt ở Việt Nam bằng chỉ thị
phân tử ADN, tiến hành lai và chọn tạo đƣợc một số dòng đậu tƣơng tốt mang gen
kháng bệnh hữu hiệu và kháng tốt với các chủng nấm gây bệnh gỉ sắt ở Việt Nam
Phƣơng pháp nghiên cứu
- Đề tài sử dụng 70 mẫu giống đậu tƣơng, 3 chủng nấm bệnh gỉ sắt đại diện 3
vùng sinh thái của Việt Nam và 12 chỉ thị SSR liên kết với gen kháng bệnh gỉ sắt đã
đƣợc công bố.
- Đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lƣợng và khả năng chống chịu
của tập đoàn mẫu giống đậu tƣơng: Bố trí thí nghiệm tuần tự không nhắc lại, mỗi giống
trồng 10m2, đối chứng là DT84. Chỉ tiêu theo dõi và phƣơng pháp đánh giá theo quy
phạm khảo nghiệm 10 TCN 339-2006 và QCVN 01-58: 2011/BNNPTN.
- Xác định khả năng chứa gen kháng bằng chỉ thị phân tử SSR và đánh giá tính kháng
bằng lây nhiễm nhân tạo. Lây nhiễm nhân tạo theo Nguyễn Thị Bình và cs. (1990).
- Sử dụng các chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng
đã công bố, lựa chọn chỉ thị liên kết chặt, rồi ứng dụng trong chọn lọc các thế hệ con lai.
- Lai đơn, lai backcross và ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc các cá thể từ quần
thể phân ly.
Kết quả chính và kết luận
- Bằng chỉ thị phân tử ADN đã phát hiện có 28/70 mẫu giống đậu tƣơng mang gen
kháng từ Rpp1 – Rpp5.
- Xác định đƣợc 3 gen kháng hữu hiệu với các chủng nấm gây bệnh gỉ sắt đậu
tƣơng ở Việt Nam là Rpp2, Rpp4 và Rpp5.
- Đã lựa chọn đƣợc 3 chỉ thị phân tử liên kết chặt với 3 gen kháng hữu hiệu là chỉ
thị Satt620 liên kết chặt với gen Rpp2 với khoảng cách 3,33 cM; chỉ thị Satt288 với gen
xi
Rpp4 là 2,50 cM và Sat_275 với gen Rpp5 là 4,16 cM.
- Chọn tạo thành công 2 dòng đậu tƣơng triển vọng (Đ9 và Đ10) mang gen kháng
hữu hiệu Rpp2, có năng suất khá, thời gian sinh trƣởng ngắn, góp phần đa dạng hóa bộ
giống đậu tƣơng của Việt Nam.
xii
THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Nguyen Van Khoi
Thesis title: Application of molecular marker for breeding soybean lines resistant to rust
disease (Phakopsora pachyrhizi Sydow)
Major: Plant Genetics and Breeding
Code: 9 62 01 11
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
Detecting soybean accessions resistant to soybean rust disease in Vietnam using
molecular markers and artificial inoculation and developing some promising lines, which
carry the effective resistance genes conferring high level of resistance to different isolates
of rust fungi in Vietnam.
Materials and Methods
- Materials: i) 70 soybean accessions ii) 3 isolates of soybean rust fungi collected
from three different ecological areas of Vietnam and iii) 12 SSR markers linked to rust
resistance genes.
- Assessment of some main agronomical and biological traits and yield of the
soybean germplasm. The experiments were carried out with non-replication with the plot
area for each accession 10m2. DT84 was used as a control variety. The details were
described in 10 TCN. 339-2006 and QCV 01-58:2011/BNNPTN.
- Detection of the effective resistance genes using SSR markers, and assessment of
the resistance/susceptibility to the isolates of soybean rust fungi by artificial inoculation.
The detail method is described by Binh et al. (1990).
- Developing new soybean lines by hybridization of two imbred lines and
backcrossing. Elit individual plants selected from the F2 segregating population using
MAS and MABC for backcrossing populations.
Main findings and conclusions
- 28 out of 70 soybean accessions are identified carrying the resistance genes from
Rpp1 to Rpp5.
- Three genes Rpp2, Rpp4 and Rpp5 identified strongly and effectively resistance to
the isolates of soybean rust fungi in Vietnam (Rpp2 and Rpp4) and Rpp5 can resist
xiii
effectively to only the ones collected from the South of Vietnam).
- Finding three molecular markers: Satt620, Satt288 and Sat_275 closely linked to
three effective resistance genes Rpp2,Rpp4 and Rpp5 respectively.
- Developing two promising lines of soybean, namely Đ9 and Đ10 carrying the
effective resistance gene (Rpp2) with high yield and short growth duration, contribution to
the diversity of the soybean varietal collection in North Vietnam.
xiv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Đậu tƣơng (Glycine max L. Merill) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá
trị kinh tế và chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng ở nƣớc ta. Sản phầm
hạt đậu tƣơng đƣợc dùng làm thức ăn cho ngƣời và gia súc, dùng để chế biến dầu
thực vật. Ngoài ra, đậu tƣơng còn là cây trồng lý tƣởng trong công thức luân
canh, che phủ đất, chống xói mòn, có khả năng cố định đạm nên làm tăng độ phì
cho đất. Vì vậy, từ lâu việc trồng đậu tƣơng đã đƣợc quan tâm và phát triển mạnh
ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, trong những
năm gần đây ngành sản xuất đậu tƣơng ở nƣớc ta bị giảm về cả diện tích và sản
lƣợng, vì thế đã không đáp ứng đƣợc nhu cầu của xã hội, nhiều năm qua nƣớc ta
phải nhập khẩu đậu tƣơng với số lƣợng lớn. Một trong những nguyên nhân dẫn
đến ngành sản xuất đậu tƣơng của nƣớc ta kém phát triển là do chƣa có giống tốt,
nhiều giống trồng hiện nay có năng suất rất thấp chỉ đạt 1,5 - 2 tấn/ha trong khi
đó trên thế giới đã đạt ngƣỡng 2,5 – 3 tấn/ha (FAO, 2017). Trong đó, phần lớn
các giống có khả năng chống chịu với sâu bệnh, đặc biệt là bệnh gỉ sắt kém.
Bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow gây ra, là một trong
những bệnh hại chính trên cây đậu tƣơng, làm giảm nghiêm trọng đến năng suất
ở nhiều nƣớc châu Á trong đó có Việt Nam (Nguyễn Thị Bình và cs., 2007). Để
phòng chống bệnh có nhiều biện pháp khác nhau, trong đó chọn tạo và trồng
giống kháng bệnh mang lại hiệu quả kinh tế cao, không gây ô nhiễm môi trƣờng,
tạo nông sản sạch. Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện 7 gen kháng bệnh
đƣợc ký hiệu lần lƣợt là Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5, Rpp6 và Rpp1b
(Bromfield and Hartwig, 1980; McLean and Byth, 1980; Bromfield and
Melching, 1982; Hartwig and Bromfield, 1983; Hartwig, 1986; Garcia et al.,
2008; Li et al., 2012; Hossain et al., 2014). Phần lớn các gen kháng này cũng đã
đƣợc lập bản đồ và xác định các chỉ thị phân tử ADN liên kết. Theo đó, gen
kháng Rpp1 đƣợc xác định nằm trên nhiễm sắc thể (NST) số 18 và liên kết với 2
chỉ thị Sct_187 và Sat_064 với khoảng cách di truyền là 0,4 cM (Hyten et al.,
2007); Rpp2 nằm trên NST số 16, liên kết với chỉ thị Sat_255, Satt620 và Satt215
với khoảng cách di truyền lần lƣợt là 8,1 cM, 4,3 cM và 4,3 cM (Abdelnoor et
al., 2009); Rpp3 nằm trên NST số 6, liên kết với các chỉ thị Satt460, Sat_263 và
1
Sat_251 với khoảng cách di truyền lần lƣợt là 0,5 cM, 0,9 cM và 4,1 cM (David
et al., 2009); Rpp4 trên NST số 18, liên kết với chỉ thị Satt288 và Sat_191 với
khoảng cách di truyền lần lƣợt là 1,19 cM và 6,24 cM (Abdelnoor et al., 2009) và
gen kháng Rpp5 nằm trên NST số 3, liên kết với chỉ thị Sat_275 và Sat_280 với
khoảng cách di truyền là 4,6 cM và 6,3 cM (Gacia et al., 2008; Khanh et al.,
2013). Tuy nhiên, vì mỗi tác giả sử dụng những vật liệu mẫu giống để xác định
chỉ thị phân tử liên kết có khác nhau nên khoảng cách di truyền mỗi chỉ thị với
mỗi gen cũng có thể khác nhau. Ngoài ra, khoảng cách di truyền của gen có thể
thay đổi theo từng genome, đồng thời khi áp dụng trong chọn giống phân tử còn
tùy thuộc vào loại chỉ thị và điều kiện cơ sở vật chất trang thiết bị để chọn giống
phân tử. Vì thế, trƣớc khi tiến hành chọn giống phân tử nói chung và chọn giống
kháng bệnh gỉ sắt nói riêng thì cần phải lựa chọn đƣợc những chỉ thị có liên kết
chặt với gen kháng hữu hiệu với các chủng nấm bệnh quan tâm và là loại chỉ thị
dễ thực hiện.
Để chọn tạo thành công giống đậu tƣơng Việt nam kháng bệnh gỉ sắt bằng
ứng dụng chỉ thị phân tử ADN thì cần thiết phải có nguồn gen kháng phong phú,
tiếp đến phải đánh giá nguồn gen, xác định đƣợc các gen kháng hữu hiệu đối với
các chủng nấm gỉ sắt Việt Nam và lựa chọn đƣợc những chỉ thị phân tử có liên
kết chặt với mỗi gen kháng rồi tiến hành lai quy tụ nhiều gen kháng hoặc gen
kháng hữu hiệu vào giống tốt để tạo ra các dòng, giống kháng bệnh bền vững là
việc làm cần thiết và cấp bách hiện nay.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Xác định đƣợc mẫu giống đậu tƣơng chứa gen kháng bệnh gỉ sắt và chỉ thị
phân tử ADN liên kết chặt với các gen kháng hữu hiệu.
- Chọn tạo đƣợc một số dòng/giống đậu tƣơng tốt, chứa gen kháng bệnh gỉ
sắt hữu hiệu với các mẫu nấm gây bệnh gỉ sắt ở Việt Nam bằng ứng dụng chỉ thị
phân tử ADN.
1.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Một số giống đậu tƣơng thu thập, nhập nội và chọn tạo trong nƣớc, chủng
nấm bệnh gỉ sắt phân lập ở Việt Nam, các gen kháng bệnh gỉ sắt và chỉ thị phân
tử ADN liên kết.
2
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu
- Đề tài thực hiện tại Viện Cây lƣơng thực và Cây thực phẩm và Viện Bảo
vệ thực vật từ năm 2013 đến năm 2017
- Khảo sát một số đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lƣợng và khả
năng kháng bệnh gỉ sắt của tập đoàn 70 mẫu giống đậu tƣơng và các thế hệ con
lai; 3 chủng nấm bệnh gỉ sắt thu thập và phân lập từ các địa phƣơng khác nhau ở
Việt Nam; 5 gen kháng bệnh gỉ sắt Rpp1, Rpp2, Rpp3, Rpp4, Rpp5 và các chỉ thị
phân tử liên kết đã đƣợc công bố.
1.4. TÍNH MỚI VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA LUẬN ÁN
- Phát hiện đƣợc một số mẫu giống đậu tƣơng tốt và 28 mẫu giống chứa từ
1 đến 3 gen kháng bệnh gỉ sắt trong tập đoàn 70 mẫu giống, làm cơ sở dữ liệu giúp
các nhà chọn tạo giống đậu tƣơng kháng bệnh gỉ sắt tham khảo sử dụng.
- Xác định đƣợc 3 gen kháng hữu hiệu (Rpp2, Rpp4 và Rpp5), kháng tốt với
các chủng nấm gây bệnh gỉ sắt đậu tƣơng ở Việt Nam và lựa chọn đƣợc 3 chỉ thị
phân tử ADN liên kết chặt với 3 gen kháng hữu hiệu là: Satt620 liên kết chặt với
gen Rpp2 với khoảng cách di truyền là 3,33cM; Satt288 với gen Rpp4 là 2,50cM
và Sat_275 với gen Rpp5 là 4,16 cM.
- Chọn tạo thành công 13 dòng đậu tƣơng tốt chứa 1 hoặc 2 gen kháng hữu
hiệu với các chủng nấm gây bệnh gỉ sắt ở Việt Nam. Trong đó, 2 dòng VD1-2-1
(Đ9) và VD1-9-1 (Đ10), triển vọng có nhiều đặc điểm tốt đã gửi khảo nghiệm
Quốc gia.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học góp phần khẳng định
thêm tính hiệu quả của phƣơng pháp chọn tạo giống cây trồng có sự hỗ trợ của
chỉ thị phân tử ADN.
- Sản phẩm của đề tài là dữ liệu về nguồn gen kháng hữu hiệu, chỉ thị phân
tử ADN liên kết chặt với gen kháng, các dòng/giống đậu tƣơng chứa 1-2 gen
kháng hữu hiệu với bệnh gỉ sắt là dữ liệu khoa học tham khảo cho các nghiên cứu
tiếp sau về chọn tạo giống kháng bệnh gỉ sắt ở đậu tƣơng.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Hai dòng/giống đậu tƣơng (Đ9 và Đ10) có nhiều đặc điểm nông sinh học
tốt, ngắn ngày, năng suất đạt ≥ 2,5 tấn/ha ở vụ Xuân, chứa gen kháng hữu hiệu
Rpp2 kháng đƣợc nhiều chủng nấm bệnh gỉ sắt ở Việt Nam, góp phần đa dạng
hóa bộ giống đậu tƣơng ở phía Bắc Việt Nam.
3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT ĐẬU TƢƠNG
2.1.1. Tình hình sản xuất trên thế giới
Ngành sản xuất đậu tƣơng trên thế giới trong những năm gần đây tăng
mạnh cả về diện tích, năng suất và sản lƣợng. Kết quả thống kê của FAO (bảng
2.1), cho thấy từ năm 1960 đến năm 2016, diện tích gieo trồng, năng suất và sản
lƣợng đậu tƣơng trên thế giới đều tăng, đặc biệt tăng mạnh từ năm 2000 đến nay.
nhƣng 45% diện tích gieo trồng và 55% sản lƣợng đậu tƣơng của thế giới hiện
tƣơng, trong đó hơn một phần ba dùng để xuất khẩu. Các nƣớc sản xuất đậu
đậu tƣơng của Mỹ dùng để chế biến làm thức ăn nuôi gia súc, gia cầm hoặc để
xuất khẩu, mặc dù lƣợng tiêu thụ đậu tƣơng trên đầu ngƣời của nƣớc này đang
Bảng 2.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới qua một số năm
Năm
1960
1990
2000
2010
2011
2012
2013
2014
2015
2016
Diện tích (triệu ha)
21,00
Năng suất (tạ/ha)
12,00
Sản lƣợng (triệu tấn)
25,20
54,34
19,17
104,19
74,34
21,70
151,41
101,37
24,70
249,93
101,97
24,60
251,29
109,32
24,60
268,77
113,33
25,00
283,74
118,06
26,90
318,60
119,73
26,10
312,36
122,14
26,50
323,70
Nguồn: FAO (2017)
Trƣớc những năm 1970, Mỹ và Trung Quốc là hai nƣớc sản xuất đậu tƣơng
nhiều nhất thế giới. Trong đó, tốc độ sản xuất đậu tƣơng của Mỹ nhanh hơn của
Trung Quốc. Sản lƣợng đậu tƣơng của Mỹ tăng từ 60% năm 1960 lên đỉnh cao là
75% năm 1969, trong khi sản lƣợng của Trung Quốc lại giảm từ 32% xuống còn
16% trong cùng kỳ. Hiện Mỹ vẫn là nƣớc sản xuất đậu tƣơng đứng đầu thế giới
4
Tải về để xem bản đầy đủ
144 trang
23980
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo các dòng đậu tương kháng bệnh gỉ sắt (Phakopsora pachyrhizi Sydow)", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- luan_an_ung_dung_chi_thi_phan_tu_chon_tao_cac_dong_dau_tuong.pdf
- Tom tat luan an - Nguyen Van Khoi.pdf
- Trang thong tin luan an - Nguyen Van Khoi.pdf
