Luận án Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
NGUYỄN ĐỨC THÀNH
NGHIÊNCỨU BỆNHDOPHYTOPLASMAHẠI SẮN
(ManihotesculentaCrantz)TẠI MỘTSỐTỈNHĐÔNGNAMBỘ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP, NĂM 2016
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
NGUYỄN ĐỨC THÀNH
NGHIÊNCỨUBỆNHDOPHYTOPLASMAHẠISẮN
(ManihotesculentaCrantz)TẠIMỘTSỐTỈNHĐÔNGNAMBỘ
Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT
Mã số: 62 62 01 12
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. HÀ VIẾT CƢỜNG
2. TS. TRỊNH XUÂN HOẠT
HÀ NỘI, NĂM 2016
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là
trung thực, khách quan và chƣa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cảm ơn,
các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng
Tác giả luận án
năm 2016
Nguyễn Đức Thành
i
LỜI CẢM ƠN
Luận án có sử dụng một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ
bệnh chổi rồng và bệnh thán thƣ hại sắn” do Bộ Nông nghiệp và PTNT cấp kinh phí
thực hiện cho TS. Trịnh Xuân Hoạt làm chủ nhiệm đề tài và đã đƣợc cho phép sử dụng
trong luận án.
Để hoàn thành bản luận án này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận đƣợc
rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của quý thầy, quý cô và ngƣời thân.
Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Hà Viết Cƣờng và TS. Trịnh
Xuân Hoạt đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành
luận án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt
Nam, Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các
cán bộ Viện Bảo vệ thực vật, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Trung tâm Nghiên
cứu Bệnh cây nhiệt đới, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các nhà khoa học đã nhiệt tình trao đổi, góp ý cho các
vấn đề, giải pháp, trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ kỹ thuật và bà con nông dân tại nhiều nơi đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi xin gửi
lời tri ân tới tất cả ngƣời thân trong gia đình, những ngƣời luôn bên cạnh động viên,
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án này.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2016
Tác giả luận án
Nguyễn Đức Thành
ii
iv
v
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,
chữ viết tắt
cs.
Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh
Cộng sự
CT
Công thức
µl
Microliter
A. laidlawii
BIP
Acholeplasma laidlawii
Backward internal primer (Mồi ngƣợc dòng bên trong)
Basic local alignment search tool
(Công cụ tìm kiếm chuỗi tƣơng đồng cơ bản cục bộ)
Base pair (Cặp bazơ)
BLAST
bp
Ca. Phytoplasma
CRD
Candidatus Phytoplasma
Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên)
Cetyl trimethyl ammonium bromide
4‟,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride
Deoxy nucleic acid
CTAB
DAPI
DNA
EDTA
EtOH
Ethylene diamine tetraacetic acid
Ethanol
FAO
Food and agriculture organization
(Tổ chức Nông nghiệp và Lƣơng thực của Liên hiệp Quốc)
Forward internal primer (Mồi xuôi dòng bên trong)
International research project for comparative mycoplasmology
(Dự án Nghiên cứu Quốc tế về Mycoplasma)
Kilo base
FIP
IRPCM
kb
LAMP-PCR
Loop mediated isothermal amplification - PCR
(Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt)
Manihot esculenta
M. esculenta
ml
Mililiter
nm
nts
Nanometer
Nucleotides
PCR
Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
vi
RFLP
Restriction fragment length polymorphism
(Đa hình chiều dài của đoạn cắt giới hạn)
rRNA
TAE
ribosomal ribonucleic acid
Tris-acetate acid EDTA
TEM
Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua)
Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phƣơng pháp
ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng)
UPGMA
vii
ix
xi
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Tên tác giả: Nguyễn Đức Thành
Tên luận án: Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại
một số tỉnh Đông Nam Bộ.
Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
Mã số: 62 62 01 12
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số tỉnh
Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây bệnh và khả
năng lan truyền của chúng.
Phƣơng pháp nghiên cứu
* Vật liệu: Hom sắn KM94, KM419 và SM937-26 đã bị nhiễm bệnh chổi phù thuỷ đƣợc
lấy từ ruộng sản xuất của hộ nông dân. Hom sắn giống KM94 khoẻ.
* Nội dung nghiên cứu:
- Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn.
- Phát hiện phytoplasma hại sắn bằng kính hiển vi điện tử, nhuộm mô và PCR.
- Định danh phân tử và phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn.
- Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII hại sắn.
- Xác định một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do
phytoplasma gây ra.
* Phương pháp nghiên cứu:
- Phát hiện phytoplasma trên sắn bằng kính hiển vi điện tử truyền qua trên máy
JEOL 1010 và nhuộm với DAPI.
- DNA tổng số đƣợc tách chiết bằng CTAB theo tài liệu mô tả của Doyle and
Doyle (1990). Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp đƣợc thực hiện theo tài liệu của Deng
and Hiruki (1991), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996).
- Tinh chiết sản phẩm PCR dùng QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) theo
hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
- Phân tích RFLP thực hiện mô phỏng bằng chƣơng trình pDRAW32.
xii
- Sử dụng các phần mềm tin sinh học nhƣ ClustalW2, BioEdit 7.0. Cây phả hệ
đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor-Joining trong MEGA 5.0.
- Số liệu thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai
bằng chƣơng trình IRRISTAT 4.0.
Kết quả chính và kết luận
- Xác định đƣợc phytoplasma hại sắn tại Đông Nam Bộ thuộc ít nhất 2 nhóm gồm
16SrI (nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A).
- Thiết kế và thử nghiệm đƣợc bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu cho phytoplasma
nhóm 16SrII nhằm chẩn đoán bệnh chổi phù thuỷ hại sắn tại Đông Nam Bộ.
- Xác định đƣợc một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù thuỷ hại sắn do
phytoplasma gây ra, trong đó bệnh lan truyền chủ yếu qua việc sử dụng hom giống đã bị
nhiễm bệnh.
xiii
THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Nguyen Duc Thanh
Thesis title: Study on phytoplasma disease on cassava (Manihot esculenta Crantz) in
South-eastern provinces.
Major: Plant Protection
Code: 62 62 01 12
Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA).
Research objectives
Diagnosis and identification of phytoplasma disease on cassava in South-eastern
provinces; evaluation of some biological characteristics including the pathogenicity and
transmission ability of identified phytoplasma.
Materials and Methods
* Materials: Cassava varieties KM94, KM419 and SM937-26.
* Research content:
- Investigation of the prevalence of witches‟ broom disease on the cassava fields
in south of Vietnam.
- Detection of phytoplasma in cassava tissues by transmission electron
microscopy and DAPI staining technique.
- Molecular identification and phylogenetic analysis of the phytoplasma on
cassava Vietnam.
- Application of loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for
detection of the phytoplasma 16SrII group on cassava.
- Evaluation of biological characteristics of phytoplasma disease on cassava under
screen house conditions.
* Methods:
- The presence of phytoplasma in cassava tissues was identified by transmission
electron microscopy and DAPI staining technique.
- Total DNAs were extracted by CTAB method as previously described by Doyle
and Doyle (1990). Polymerase chain reactions were followed the methods of Deng and
Hiruki (1991), Lee et al. (1994), Schneider et al. (1995), Gundersen and Lee (1996).
- PCR products from agarose gel were purified by QIAquick gel extraction kit
(Qiagen) according to manufacturer‟s instructions.
xiv
- Virtual-restriction fragment length polymorphism analysis of 16S rRNA gene
was conducted by pDRAW32 program.
- Phylogenetic trees were constructed by Neighbor-Joining method in MEGA 5.0
software.
- Statistical analysis was conducted by IRRISTAT 4.0 software.
Main findings and conclusions
- The study identified two different phytoplasma groups belonging to the 16SrI
(subgroup B) and the 16SrII (subgroup A) from witches‟ broom cassava plants grown in
south-eastern provinces of Vietnam.
- The study designed loop mediated isothermal amplification (LAMP) primers
based on the 16S ribosomal RNA gene. LAMP-PCR using these primers demonstrated
to be efficient to detect the phytoplasma 16SrII group on cassava.
- The study provided new scientific data on biological characteristics of
phytoplasma disease on cassava. This disease is mainly transmitted by cutting through
vegetative propagation using diseased cassava plants.
xv
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) đƣợc trồng rộng khắp ở các tỉnh trong
cả nƣớc với nhiều vùng trồng tập trung, đem lại nguồn thu nhập cho ngƣời dân,
góp phần ổn định tình hình kinh tế - xã hội. Sắn là cây lƣơng thực, đồng thời
cung cấp nguyên liệu phục vụ cho công nghiệp chế biến, xuất khẩu và làm
nguyên liệu sinh học. Sắn đã trở thành 1 trong 10 mặt hàng nông sản xuất khẩu
quan trọng, có giá trị kinh tế cao của Việt Nam và là một trong những loại cây
trồng đƣợc ƣu tiên phát triển trong tầm nhìn chiến lƣợc đến năm 2020 của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.
Ở nƣớc ta trong những năm gần đây, trên cây sắn xuất hiện một loại bệnh
mới đƣợc gọi là bệnh chổi phù thuỷ (hay bệnh chổi rồng) với biểu hiện triệu
chứng đặc trƣng do bị nhiễm phytoplasma, nhƣ cây mọc nhiều chồi phụ ở ngọn
và phần thân chính, lá biến vàng. Bệnh chổi phù thuỷ hại sắn đƣợc ghi nhận xuất
hiện rải rác từ năm 2005 trên giống sắn KM94 tại một số huyện của tỉnh Quảng
Ngãi và đã trở thành dịch nghiêm trọng tại nhiều vùng trồng sắn thuộc một số
tỉnh Đông Nam Bộ nhƣ Bà Rịa-Vũng Tàu và Đồng Nai.
Cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ, năng suất giảm 10 - 30%, hàm lƣợng tinh
bột giảm 20 - 30% (Nguyên Khê, 2011). Ở các khu vực tiến hành trồng lại hay
trồng mới thuộc các tỉnh Đông Nam Bộ, bệnh chổi phù thuỷ sắn vẫn xuất hiện,
gây quan ngại cho nông dân và chính quyền địa phƣơng. Do nguyên nhân gây
bệnh chƣa đƣợc xác định chính xác nên việc quản lý bệnh gặp nhiều lúng túng. Ở
một số vùng trồng sắn, nông dân đã tiến hành thử nghiệm các loại thuốc trừ nấm
để xử lý hom và phun cho cây sắn khi xuất hiện bệnh chổi phù thuỷ. Tuy nhiên,
các biện pháp này đều không có hiệu quả phòng chống bệnh.
Cây sắn bị nhiều bệnh gây hại khác nhau, trong đó có bệnh phytoplasma.
Bệnh phytoplasma hại sắn đã đƣợc ghi nhận ở một số vùng trồng sắn trên thế
giới nhƣ quần đảo Wallis-Futuna, Uganda, Cuba, một số nƣớc thuộc châu Mỹ và
châu Á. Phytoplasma gây hại trên cây sắn xác định đƣợc liên quan đến bệnh biến
vàng lá, bệnh chổi phù thuỷ và bệnh da cóc. Ở Brazil, tại một số vùng trồng sắn
thuộc phía đông bắc nƣớc này, tỷ lệ cây sắn bị bệnh chổi phù thuỷ lên đến 85%
và năng suất củ giảm đến 70% (Flôres et al., 2013), thậm chí năng suất củ giảm
sút đến 90% cũng đã đƣợc ghi nhận (Lozano, 1992).
1
Phytoplasma là một tác nhân đặc biệt gây bệnh trên cây trồng. Phytoplasma
không thể nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo, tế bào thiếu lớp vách bên ngoài
do bộ gen của chúng đã bị suy thoái mạnh. Con đƣờng lan truyền của phytoplasma
ngoài tự nhiên là qua nhân giống vô tính và qua côn trùng môi giới. Do
phytoplasma không nuôi cấy đƣợc trên môi trƣờng nhân tạo nên chẩn đoán và
phân loại nhóm tác nhân gây bệnh này chủ yếu dựa trên phân tích một số vùng
gen, quan trọng nhất là gen mã hóa 16S RNA ribosome (Bertaccini et al., 2014).
Trên thế giới, phytoplasma gây bệnh trên hàng trăm loại cây trồng khác
nhau và số lƣợng bệnh mới do phytoplasma gây ra tăng theo từng năm
(Bertaccini et al., 2014). Ở Việt Nam, những nghiên cứu về bệnh phytoplasma
trên cây trồng còn hạn chế. Các kết quả điều tra cơ bản trƣớc đây đều chƣa phát
hiện ra bệnh phytoplasma ở Việt Nam. Gần đây, dựa trên đánh giá triệu chứng và
chẩn đoán phân tử, nguyên nhân gây bệnh chồi cỏ mía và trắng lá mía đã đƣợc
xác định là do phytoplasma gây ra (Hoat et al., 2012, 2013). Hai bệnh này đã gây
thành dịch nghiêm trọng tại một số vùng trồng mía trọng điểm của Việt Nam.
Phòng chống hiệu quả bệnh cây nói chung và bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
nói riêng phụ thuộc nhiều yếu tố, trong đó, đầu tiên là phải xác định chính xác tác
nhân gây bệnh và các đặc điểm sinh học của bệnh. Do bệnh chổi phù thuỷ hại sắn
là một bệnh mới ở Việt Nam nên cần phải thực hiện nghiên cứu về bệnh, đặc biệt
tại các tỉnh trọng điểm có dịch ở Đông Nam Bộ.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Chẩn đoán và phân loại đƣợc phytoplasma gây hại trên cây sắn tại một số
tỉnh Đông Nam Bộ; đánh giá đƣợc một số đặc điểm sinh học chính nhƣ tính gây
bệnh và khả năng lan truyền của chúng.
1.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Phytoplasma gây hại trên cây sắn, tập trung vào lĩnh vực chẩn đoán, phân
loại và một số đặc điểm sinh học.
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu
Điều tra mức độ phổ biến của bệnh chổi phù thủy hại sắn ở Đông Nam Bộ,
xác định nguyên nhân phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy hại sắn. Nghiên cứu
biện pháp chẩn đoán, xác định và phân loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy
hại sắn và khả năng lan truyền của bệnh phytoplasma hại sắn ở điều kiện chậu
vại trong nhà lƣới.
2
1.3.3. Địa điểm thời gian nghiên cứu
Điều tra trên đồng, thu thập mẫu đƣợc thực hiện tại một số tỉnh Đông Nam
Bộ gồm Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dƣơng, Bình Phƣớc, Tây Ninh và
một số tỉnh khác, bao gồm Phú Thọ, Yên Bái, Quảng Ngãi, Kon Tum.
Các nghiên cứu liên quan tới xác định đặc điểm sinh học đƣợc thực hiện tại
Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc; nghiên cứu chẩn
đoán, phân loại phytoplasma hại sắn đƣợc thực hiện tại Viện Bảo vệ thực vật và
Trung tâm Nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới.
Thời gian thực hiện các thí nghiệm trong đề tài từ năm 2011 đến năm 2014.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài đã xác định đƣợc bệnh chổi phù thủy hại sắn tại Việt Nam do
phytoplasma gây ra. Phytoplasma hại sắn tại Việt Nam thuộc 2 nhóm gồm 16SrI
(nhóm phụ 16SrI-B) và 16SrII (nhóm phụ 16SrII-A). Riêng mẫu phytoplasma hại
sắn YB-01 (KM360166) ở Yên Bái thuộc nhóm 16SrI nhƣng nằm trong nhóm
phụ hoàn toàn mới, chƣa đƣợc công bố.
Áp dụng thành công kỹ thuật nhuộm mô cây bằng DAPI để phát hiện
phytoplasma hại sắn tại Việt Nam.
Thiết kế thành công bộ mồi LAMP-PCR đặc hiệu để xác định phytoplasma
nhóm 16SrII hại sắn tại Đông Nam Bộ. Đề xuất đƣợc quy trình chẩn đoán
phytoplasma hại sắn cho một số tỉnh Đông Nam Bộ.
Cung cấp dẫn liệu khoa học về một số đặc điểm sinh học của bệnh chổi phù
thuỷ hại sắn do phytoplasma gây ra. Xác định đƣợc con đƣờng lan truyền chính
của bệnh là qua nhân giống vô tính đã bị nhiễm bệnh.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đã xác định đƣợc phytoplasma là nguyên nhân gây bệnh chổi phù thuỷ hại
sắn tại Đông Nam Bộ, phân loại đƣợc phytoplasma hại sắn ở Việt Nam thuộc 2
nhóm 16SrI và 16SrII. Đã ứng dụng thành công các kỹ thuật để chẩn đoán, phân
loại phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy trên sắn nhƣ kính hiển vi điện tử, kỹ
thuật nhuộm mô cây bằng DAPI, kỹ thuật PCR lồng, kỹ thuật RFLP và kỹ thuật
LAMP-PCR. Xác định đƣợc con đƣờng lan truyền của phytoplasma gây bệnh
chổi phù thủy trên sắn tại Đông Nam Bộ là chủ yếu qua nhân giống vô tính.
3
Tải về để xem bản đầy đủ
178 trang
25360
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu bệnh do phytoplasma hại sắn (Manihot esculenta Crantz) tại một số tỉnh Đông Nam Bộ", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- luan_an_nghien_cuu_benh_do_phytoplasma_hai_san_manihot_escul.pdf
- BVTV - TTLA - Nguyen Duc Thanh.pdf
- TTT - Nguyen Duc Thanh.pdf
