Luận án Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam
HỌC VIỆN NÔ NG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
PHẠM VĂN SƠN
NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM
SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒ NG HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ
CHỦNG VIRUS PHÂ N LẬP TẠI VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔ NG NGHIỆP - 2018
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
PHẠM VĂN SƠN
NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM
SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ
CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Mã số:
9.64.01.02
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên
2. TS. Nguyễn Văn Cảm
HÀ NỘI, 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết
quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa
từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2018
Tác giả luận án
Phạm Văn Sơn
i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện
của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả:
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên
và TS. Nguyễn Văn Cảm, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu và hoàn thành luận án. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý
kiến đóng góp quý báu của các thầy mà luận án của tôi đã được hoàn thành.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt
Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật -
Truyền nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng
toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp
Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành
công trình nghiên cứu này.
Trân trọng cảm ơn nhóm các nhà Khoa học nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu
công nghệ sản xuất vacxin vô hoạt phòng Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp
ở lợn”. Thuộc chương trình KC-04 do PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm đã
tạo điều kiện cho chúng tôi tham gia nhiều công đoạn nghiên cứu và cho phép tôi
sử dụng một số kết quả nghiên cứu trong luận án này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và cơ
quan mà tôi đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất,
tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2018
Nghiên cứu sinh
Phạm Văn Sơn
ii
MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn........................................................................................................................ii
Mục lục ............................................................................................................................iii
Danh mục chữ viết tắt.....................................................................................................vii
Danh mục bảng ................................................................................................................ ix
Danh mục hình................................................................................................................. xi
Trích yếu luận án ........................................................................................................... xiv
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài........................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu của đề tài................................................................................................ 2
1.2.1. Mục tiêu chung...................................................................................................... 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể...................................................................................................... 2
1.3. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 2
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 2
1.3.2. Phạm vi nghiên cứu............................................................................................... 3
1.4. Những đóng góp mới của đề tài............................................................................ 3
1.5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài................................................. 3
1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài.................................................................................. 3
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .................................................................................. 4
Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 5
2.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn .................................................................. 5
2.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới.............................................. 5
2.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam............................................. 8
2.2. Căn bệnh ............................................................................................................. 14
2.2.1. Cấu trúc virus PRRS ........................................................................................... 14
2.2.2. Phân loại virus PRRS.......................................................................................... 17
2.3. Truyền nhiễm học ............................................................................................... 19
2.3.1. Loài vật mắc bệnh............................................................................................... 19
iii
2.3.2. Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây ..................................................... 19
2.4. Triệu chứng và bệnh tích .................................................................................... 22
2.4.1. Triệu chứng lâm sàng.......................................................................................... 22
2.4.2. Bệnh tích ............................................................................................................. 23
2.5. Chẩn đoán và phòng trị bệnh.............................................................................. 24
2.5.1. Chẩn đoán ........................................................................................................... 24
2.5.2. Các biện pháp phòng trị bệnh ............................................................................. 25
2.6. Giống gốc trong sản xuất vacxin ........................................................................ 27
2.6.1. Định nghĩa........................................................................................................... 27
2.6.2. Cách chế tạo giống gốc....................................................................................... 27
2.6.3. Cách quản lý giống gốc....................................................................................... 27
2.7. Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng PRRS.......................................................... 30
2.7.1. Sản xuất vacxin bằng phương pháp vô hoạt virus .............................................. 30
2.7.3. Phương pháp sản xuất vacxin thế hệ mới ........................................................... 32
Phần 3. Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................. 36
3.1. Địa điểm nghiên cứu........................................................................................... 36
3.2. Thời gian nghiên cứu.......................................................................................... 36
3.3. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 36
3.4. Nội dung nghiên cứu........................................................................................... 36
3.4.2. Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV.............................................. 36
3.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 37
3.5.1. Phương pháp mổ khám ....................................................................................... 37
3.5.2. Phương pháp RT - PCR ...................................................................................... 37
3.5.3. Phương pháp làm tiêu bản vi thể......................................................................... 40
3.5.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào.............................................................................. 41
3.5.5. Phương pháp nhân virus PRRS........................................................................... 43
3.5.6. Phương pháp xác định hiệu giá virus.................................................................. 43
iv
3.5.7. Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus........................................ 43
3.5.8. Phương pháp giải trình tự gen............................................................................. 44
3.5.10. Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột ......................................................... 45
3.5.12. Phương pháp IPMA ............................................................................................ 47
bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR ............................................................................... 50
3.5.16. Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng lọc tiếp tuyến......................................... 50
3.5.17. Phương pháp vô hoạt virus ................................................................................. 51
3.5.18. Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt...................................................................... 51
3.5.19. Phương pháp nhũ hóa vacxin.............................................................................. 52
3.5.20. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin....................................... 52
3.5.21. Kiểm tra chỉ tiêu an toàn..................................................................................... 53
3.5.22. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin............................................ 53
3.5.23. Phương pháp Realtime RT-PCR......................................................................... 54
3.5.24. Phương pháp ELISA........................................................................................... 55
3.5.25. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu .................................................................. 56
Phần 4. Kết quả và thảo luận....................................................................................... 57
4.1.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm.................................................................................... 57
4.1.3. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể ................................................................... 60
4.1.4. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể..................................................................... 62
phân lập tại Việt Nam ......................................................................................... 71
4.2.3. Đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus PRRS........................................ 79
v
PRRS nghiên cứu................................................................................................ 98
4.2.5. Sản xuất giống gốc............................................................................................ 102
4.3.1. Nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin.................................................... 107
4.3.3. Nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS............................................... 115
Phần 5. Kết luận và kiến nghị.................................................................................... 123
5.1. Kết luận............................................................................................................. 123
5.2. Kiến nghị........................................................................................................... 123
Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án.......................................... 124
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 125
Phụ lục .......................................................................................................................... 137
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
BEI
Viết đầy đủ
Binary Ethylenimine
CSF
Classical swine fever
CPE
Cytophathogenic Effect
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
Dimethyl sulfoxide
DMEM
DMSO
DNA
EDTA
EMCV
ELISA
FBS
Deoxyribonucleic acid
Ethylenediaminetetraacetic acid
Encephalomyocarditis virus
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
Fetal Bovine Serum
GP
Glyco protein
HE
Haematoxylin – Eosin
IFA
Immunofluorescence assay
Immuno Histochemistry
Immunoperoxidase monolayer Assay
Kháng kháng thể
IHC
IPMA
KKT
MLV
MOI
Modifier Live Vacine
Multiplicity Of Infection
Mystery Swine Disease
Non structural protein
MSD
NSP
OD
Optical Density
OIE
Office International des Epizooties
Open Reading Frame
ORF
PAM
PBS
Porcine Alveolar Macrophage
Photphat Buffer Saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
Porcine circovirus type 2
Porcine epidemic diarrhea virus
Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome
PCV2
PEDV
PEARS
vii
Từ viết tắt
PPV
Viết đầy đủ
Porcine parvovirus
PPLO
PRRS
PRRSV
PRV
Pleuropneumonia-like organism
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
Porcine Pseudorabies virus
Ribonucleic acid
RNA
RT- PCR
SIRD
SIV
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
Swine Infertility and Respiratory Disease
Swine Influenza Virus
S/P
Sample/Positive
SP
Structural protein
TAE
Tris-acetate-EDTA
TCID50
TGE
50% Tissue Culture Infective Dose
Transmissible gastroenteritis
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine
Triptose phosphas broth
TMB
TPB
viii
DANH MỤC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
Lịch sử phát hiện bệnh.......................................................................................... 6
Một số tên thường gặp trong các tài liệu .............................................................. 6
Protein cấu trúc của PRRSV................................................................................. 7
Cấu trúc và chức năng protein phi cấu trúc........................................................ 16
Các vacxin đã thử nghiệm sản xuất.................................................................... 33
Thành phần phản ứng RT – PCR........................................................................ 38
Chu kỳ nhiệt trong máy PCR.............................................................................. 39
Chương trình chạy PCR giải trình tự.................................................................. 44
Bệnh tích đại thể ở phổi lợn mắc PRRS............................................................. 60
đời cấy chuyển.................................................................................................... 73
phân tử................................................................................................................ 79
ix
và các chủng tham chiếu..................................................................................... 81
và một số chủng tham chiếu ............................................................................... 86
và một số chủng tham chiếu ............................................................................... 88
virus PRRS nghiên cứu..................................................................................... 101
4.25. Kết quả kiểm tra vô trùng của giống gốc PRRS............................................... 103
4.27. Kết quả nhân giống sản xuất vacxin PRRS...................................................... 108
tiêm vacxin sử dụng chất bổ trợ khácnhau ....................................................... 113
4.35. Kết quả sản xuất vacxin vô hoạtnhũ dầu PRRS ............................................... 115
4.36. Kết quả kiểm tra cảm quan các lô nhũ hoá....................................................... 115
4.37. Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PRRS.............................................. 116
4.38. Kết quả kiểm tra thuần khiết vacxin vô hoạt PRRS ......................................... 116
4.42. Kết quả đánh giá công cường độc .................................................................... 120
x
DANH MỤC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
Cấu trúc virus PRRS........................................................................................... 15
Cấu trúc genome virus PRRS............................................................................. 16
Cây phả hệ của virus PRRS................................................................................ 17
Gen từ các chủng virus khác nhau...................................................................... 34
Tai sung huyết .................................................................................................... 58
Viêm mí mắt, có rử mắt...................................................................................... 58
Ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn........................................................................................ 58
Sảy thai ............................................................................................................... 58
Viêm phổi thùy................................................................................................... 61
Hạch lympho sưng to.......................................................................................... 61
Thận xuất huyết .................................................................................................. 61
Lách nhồi huyết .................................................................................................. 61
4.10. Viêm phổi (HE×10)............................................................................................ 64
4.11. Dịch tiết trong lòng phế nang (HE×40)............................................................. 64
4.12. Gan sung huyết (HE×10).................................................................................... 64
4.13. Gan thâm nhiễm tế bào viêm (HE×40)............................................................... 64
chủng virus PRRS phân lập được....................................................................... 70
điểm khác nhau................................................................................................... 74
thời điểm khác nhau ........................................................................................... 76
thời điểm khác nhau ........................................................................................... 77
thời điểm khác nhau ........................................................................................... 77
xi
thời điểm khác nhau ........................................................................................... 77
thời điểm khác nhau ........................................................................................... 78
nghiên cứu .......................................................................................................... 80
nghiên cứu .......................................................................................................... 80
nghiên cứu .......................................................................................................... 82
cứu và một số chủng tham chiếu ........................................................................ 85
nghiên cứu .......................................................................................................... 87
4.26. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF5.............................................................. 90
4.27. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF7.............................................................. 91
của chủng KTY-PRRS-01 .................................................................................. 92
qua 5 đời cấy chuyển.......................................................................................... 93
cấy chuyển.......................................................................................................... 94
qua 5 đời cấy chuyển.......................................................................................... 94
cấy chuyển.......................................................................................................... 95
qua 5 đời cấy chuyển.......................................................................................... 96
cấy chuyển.......................................................................................................... 97
xii
TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Tên tác giả: Phạm Văn Sơn
Tên Luận án: “Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng
hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam”.
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Mã số: 9.64.01.02
Tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS ở Việt Nam sử
dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS. Giống gốc là
chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam, có tính đại diện cho các chủng virus đang
lưu hành tại Việt Nam, có đặc tính sinh học và sinh học phân tử ổn định qua nhiều đời
cấy chuyển, đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, có khả năng kích thích miễn dịch
ở lợn để sản sinh kháng thể kháng virus PRRS tương ứng và có tương đồng kháng
nguyên rộng rãi với các chủng thực địa. Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô
hoạt PRRS từ giống gốc PRRS đã được tuyển chọn đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần
khiết, an toàn và hiệu lực.
Phương pháp nghiên cứu
Để nghiên cứu các nội dung của đề tài, chúng tôi đã áp dụng các phương pháp
nghiên cứu sau: những phương pháp thường quy để nghiên cứu virus như: nuôi cấy tế
bào, xác định hiệu giá virus, xác định quy luật sinh trưởng của virus, gây tối miễn dịch,
phương pháp trung hòa virus. Phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu virus
như: giải trình tự gen. Phương pháp sản xuất vacxin vô hoạt trên môi trường tế bào như:
nuôi cấy tế bào trên Bioreactor, vô hoạt virus. Phương pháp kiểm nghiệm vacxin vô
hoạt PRRS như: kiểm tra vô trùng, thuần khiết, kiểm tra chỉ tiêu an toàn và hiệu lực.
Kết quả chính và kết luận
Đề tài đã thu thập mẫu từ 57 ca bệnh nghi mắc PRRS ở lợn được nuôi tại Việt
Nam. Chẩn đoán được 33 ca bệnh dương tính với virus PRRS bằng kỹ thuật RT-PCR.
Xác định các triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS chúng tôi thấy rằng các triệu
chứng lâm sàng chủ yếu là sốt cao, bỏ ăn, thân ửng đỏ, tiêu chảy, tai xanh tím, chảy
nước mũi, khó thở và rối loạn sinh sản ở lợn nái. Bệnh tích đại thể bao gồm các biến đổi
chủ yếu ở phổi, hạch lympho với hiện tượng viêm, xuất huyết. Bệnh tích vi thể ở phổi,
hạch phổi rất rõ ràng, 100% các tiêu bản đọc thấy xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm,
các phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm.
xiv
Phân lập được 33 chủng virus PRRS từ lợn mắc PRRS tự nhiên ở Việt Nam. Các
chủng virus này khả năng gây bệnh tích tế bào sau 48h đến 60h gây nhiễm và tế bào bị phá
hủy hoàn toàn sau 84h đến 108h. Các chủng virus phân lập có hiệu giá từ 1,44 x 102 đến
3,16 x 106 TCID50/ml. Xác định quy luật nhân lên của các chủng virus trên môi trường nuôi
cấy thấy hiệu giá virus đạt cao nhất ở thời điểm 72h sau gây nhiễm. Qua khảo sát, sàng lọc
các đặc tính sinh học lựa chọn được 10 chủng virus PRRS điển hình để nghiên cứu sự ổn
định đặc tính sinh học qua 5 đời cấy chuyển. Kết quả nghiên cứu sự ổn định đặc tính sinh
học lựa chọn được 03 chủng virus PRRS là KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-
03 để nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử và khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên lợn.
Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch và tương đồng kháng nguyên của 3 chủng virus nghiên
cứu thấy rằng lựa chọn chủng virus KTY-PRRS-01 là thích hợp nhất cho nghiên cứu tiếp để
làm giống gốc sản xuất vacxin vô hoạt PRRS. Chủng virus KTY-PRRS-01 có hiệu giá đạt
3,16x106TCID50/ml, có đặc điểm sinh trưởng ổn định trên môi trường tế bào MARC-145,
sau 5 đời cấy chuyển đã ổn định về đặc tính sinh học và đặc tính sinh học phân tử của gen
ORF5 và ORF7, có khả năng kích thích cơ thể lợn sản sinh kháng thể trung hòa cao.
Giống gốc virus PRRS phục vụ sản xuất vacxin vô hoạt đạt chỉ tiêu vô trùng và
thuần khiết. Nhân được 3 lô giống, mỗi lô 1 lít bằng hệ thống Bioreactor, 100% các lô
đạt giống tiêu chí vô trùng và thuần khiết. Cô đặc virus PRRS bằng hệ thống lọc tiếp
tuyến thu được virus sau cô đặc đạt hiệu giá 4,0 x107 TCID50/ml phục vụ sản xuất vacxin.
Virus vacxin được vô hoạt bằng formalin nồng độ 0,03% ủ trong thời gian 24 giờ và
được trung hòa bằng L-glutamin 3%. Lựa chọn chất bổ trợ nhũ dầu (ISA740) bổ sung
vào vacxin theo tỉ lệ 1:1. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công 3 lô vacxin vô
hoạt PRRS từ giống gốc KTY-PRRS-01. Mỗi liều vacxin chứa ít nhất 107TCID50 virus
PRRS đã vô hoạt. Vacxin vô hoạt PRRS nghiên cứu sản xuất ra đạt các chỉ tiêu về vô
trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực trong phòng thí nghiệm.
xv
THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Pham Van Son
Thesis title: Study on selected master seed virus and testing manufacture of inactivated
vaccine for prevention of PRRS in pigs using virus strain isolated from pigs in Vietnam
Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals
Code: 9.64.01.02
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture
Research Objectives
PRRS virus strain isolated from infected pigs will have been selected as master
virus seed for experimental manufacture of PPRS inactivated vaccine. Master virus seed
was PRRS virus strain isolated from pigs in Vietnam that representative of existing
virus in Vietnam with stable biological and molecular characteristic through many
passages in culture reaching standard of purification and sterilization, having potential
to stimulate immune system to produce antibodies against PRRS virus respectively and
will have similar antigenicity to that of field virus isolates. Successful manufacture of
PPRS inactivated vaccine from selected master virus seed will reach standard of
sterilization, purification, safety and efficacy.
Materials and Methods
In order to perform the main content of the dissertation, we used the methods as
follows: traditional methods for studying virus including cultures of viruses,
determiation of virus titer in infected pigs in Vietnam.
Determination of virus growth rules, virus neutralization test, biological molecules
test in virus study including gene sequence, inducing immunity, methods for
manufacture of inactivated vaccine in cells such as culture of cells on Bioreactor,
inactivating virus, methods for testingPRRS inactivated vaccine includingsterilization,
purìfication testing, and safety and efficacy testing.
Main results and conclusions
The study findingindicated that 57 suspicious PPRS infected cases were found, 33
cases positive with RT-PCR were diagnosed by using RT-PCR. Main clinical
manifestation of PPRS infected Pigs included high fever, anorexiarash, diarrhea, blue
ear, lesions in the lung, lymphadenitis with hemorrchage. Microscopic lesions mainly in
xvi
the lung included swelling of lymph nodes in the lung. 100% of smear of the lung
showed hemorrchage, infiltrated with inflamed cells. Alveoli were filled with exudate.
33 PRRS virus strains from PRRS infected pigs in Vietnam were isolated. These strains
were capable of causing cellular lesions 48h - 60h after infection and the cells were
completely destroyed from 84h - 108h after infection. The titer of strains isolated was
from 1.44 x 102 to 3.16 x 106. Determination of the replication of virus strains on
culture medium showed the highest viral titer at 72h post-infection. Through the
investigation and screening of their biological characteristic, 10 typical PRRSV strains
were selected in order to study stability of their biological characteristics through 5
passges to cell cultures. As the results of the study on the stability of biological
characteristics, 3 PRRSV strains were selected including KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-
02, KTY-PRRS-03 to study molecular biology and ability of Immune response of pigs
From the results of testing immune respond and antigenic similarity of the 3 virus
strains studied. It was found that KTY-PRRS 01 was the most appropriate for further
study that can be used as master virus seed for manufacture of PRRS inactivated
vaccine. KTY PRRS virus strain 01 had high titer reaching 3.16x106/ml that had stable
growth on Marc 145 cell line medium. After 5 passages to cell cultures, their biological
and molecular characteristics were stable, which were capable of stimulating pig to
produce high neutralizing antibodies.
PRRS master seed used for inactivated vaccines achieved criteria of sterility and
purity. It was propagated in 3 batches of PRRS Master seed by using Bioreactor system.
Each batch contained 1 liter of PRRS virus, 100% of Master seed batches met criteria of
sterility and purity. PRRS virus was concentrated by using tangential filtration system.
After being concentrated, the virus titer reached 4.0 x 107/ml that was used for vaccine
production. Vaccines were inactivated by using 0.03% formalin, incubated for 24 hours
and neutralized with 3% L-glutamine. Oil emulsion as vaccine adjuvant (ISA740) was
added to viral vaccine at ratio 1:1 appropriate for manufacture of PRRS inactivated
vaccine. Study on manufacture of 3 batches of PRRS inactivated vaccine from KTY-
PRRS-01 isolated from PRRS high virulent virus strain in Vietnam used as master seed
was sucessful. Each vaccine dose contained at least 107TCID50 inactivated PRRSV
virus. Inactivated PRRS vaccine produced met criteria of sterility, purity, safety and
efficacy in the laboratory.
xvii
PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome - PRRS) hay bệnh tai xanh được đặc trưng bởi những rối
loạn sinh sản của lợn nái và những vấn đề về đường hô hấp ở lợn con và lợn
trưởng thành (Meulenberg et al., 1993). Bệnh gây ra bởi virus PRRS, thuộc bộ
Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Cavanagh, 1997). Virus PRRS
được nhóm thành hai kiểu gen, châu Âu (type 1) và Bắc Mỹ (type 2), các dấu
hiệu lâm sàng của nhiễm trùng đều giống nhau, nhưng các chủng phân lập lại
khác nhau về độc lực ở động vật nhiễm bệnh (Halbur et al., 1995b) và khác nhau
về đặc tính kháng nguyên, di truyền (Meng, 2000; Nelsen et al., 1999; Nelson et
al., 1993). Dịch PRRS xuất hiện ở hầu hết các khu vực chăn nuôi lợn quy mô
lớn trên khắp thế giới. Tổn thất hàng năm cho ngành chăn nuôi lợn ở Hoa Kỳ do
PRRSV gây ra ước tính khoảng 664 triệu USD (Holtkamp et al., 2013). Đối với
lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: lợn con sơ sinh yếu ớt, giảm số con
sơ sinh sống sót/ổ, tình trạng bệnh âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo dài,
chậm động dục trở lại. Đối với đực giống, số lượng tinh dịch giảm, chất lượng
tinh dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con (Pejsak et al.,
1997). Kháng thể kháng PRRSV lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam năm
1997 trên một đàn lợn nhập từ Mỹ. Từ năm 2007 đến nay, PRRS liên tục xảy ra
và bùng phát ở rộng khắp các tỉnh thành trong cả nước gây thiệt hại nặng nề cho
ngành chăn nuôi. Tình hình PRRS ngày càng phức tạp đòi hỏi sự chủ động trong
phòng chống dịch, trong đó phương pháp phòng PRRS hiệu quả nhất là sử dụng
vacxin. Tuy nhiên chính sự đa dạng di truyền và thay đổi kháng nguyên của các
chủng PRRSV là một trở ngại lớn trong việc phát triển một loại vacxin có hiệu
quả để kiểm soát PRRS. Các vacxin sống đã được sử dụng phổ biến để kiểm
soát PRRS vì chúng có khả năng bảo vệ tốt hơn so với vacxin đã vô hoạt hoặc
các vacxin tái tổ hợp (Charerntantanakul, 2012; Hu and Zhang, 2014; Kim et al.,
2011; Zuckermann et al., 2007). Nhưng ngày càng có nhiều quan ngại về sự an
toàn của việc sử dụng vacxin sống vì sự hồi phục nhanh chóng độc lực của
PRRSV trong quá trình sao chép ở lợn (Hu and Zhang, 2014; Mengeling et al.,
2003; Pejsak et al., 1997). Vacxin vô hoạt có ưu điểm lớn nhất là an toàn do
1
Tải về để xem bản đầy đủ
158 trang
23820
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- luan_an_nghien_cuu_tao_giong_goc_va_thu_nghiem_san_xuat_vacx.pdf
- BLH&CBVN - TTLA - Pham Van Son.pdf
TTT - Pham Van Son.docx- TTT - Pham Van Son.pdf
