Application of fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify quickly some marine toxic algae species in Vietnam

Application of fluorescent in situ

hybridization (FISH) to identify quickly some

marine toxic algae species in Vietnam

Luu Xuan Hoa

Hanoi University of Science,VNU; Faculty of Biology

Major: Genetics; Code: 60 42 70

Supervisors: Ass. Prof. Dr. Dinh Doan Long

Date of Presenting Thesis: 2011

Abstract. Tổng quan về kỹ thuật FISH: khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

(FISH); tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam; các bước cơ bản

của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ FISH; đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo

biển độc hại nghiên cứu. Nghiên cứu về vật liệu và phương pháp nghiên cứu: địa điểm

thu mẫu và đối tượng nghiên cứu; phương pháp thu và lưu giữ mẫu; phương pháp phân

loại hình thái; phương pháp kiểm tra phân loại bằng AND và thiết kế đầu dò; phương

pháp lai huỳnh quang tại chỗ. Trình bày các kết quả nghiên cứu: kết quả phân lập và

phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái; ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh

khối vi tảo tạo nguyên liệu; kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên

cứu; tối ưu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò

Keywords. Di truyền học; Kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang; Tảo độc; Biển

Content

MỞ ĐẦU

Trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du biển nói chung và vi tảo biển độc hại nói

riêng, nhiều nhóm loài sinh vật rất khó hoặc hoàn toàn không thể phân loại đến loài nếu chỉ

bằng phương pháp so sánh hình thái. Sự giống nhau về nhiều đặc điểm hình thái bên ngoài và

khó nhận biết những đặc điểm khác nhau của chúng rất dễ dẫn đến nhầm lẫn trong nghiên cứu

phân loại. Cùng với số lượng loài rất lớn có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, công tác

nghiên cứu phân loại vi tảo biển trong nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian.

Những điều này đã gây cản trở đối với công tác nghiên cứu hệ sinh thái biển, đánh giá và quản

lý nguồn lợi sinh vật biển nói chung và các nghiên cứu chuyên sâu về các nhóm loài nói riêng.

Kế thừa các đặc tính ưu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và trên nền tảng của

kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH), kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence

in situ hydridization - FISH) đã được phát triển. Kể từ khi ra đời, nó đã trở thành một công cụ

mạnh trong nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ các lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, mà

cả trong các nghiên cứu về sinh thái học, môi trường, trong chẩn đoán và nghiên cứu phát sinh

loài. Kỹ thuật FISH ra đời đã khắc phục được nhiều trở ngại trong nghiên cứu phân loại sinh

vật. Các trở ngại, như các vấn đề khó khăn do phân loại bằng hình thái, nhược điểm về thời

gian phân tích kéo dài, các yêu cầu đòi hỏi về lượng mẫu lớn hay các yêu cầu về môi trường

nuôi cấy đặc chủng để sàng lọc loài… có thể được khắc phục bằng kỹ thuật FISH. Bên cạnh đó,

bằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu không chỉ phân tích định tính mà còn có thể định lượng

chính xác số lượng tế bào sinh vật, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường của

các vi sinh vật. Kỹ thuật FISH đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du

trong môi trường biển nói chung và các loài tảo độc hại nói riêng.

Nhằm từng bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải quyết những khó khăn trong phân loại

các loài vi tảo độc hại biển, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh

quang (FISH) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại biển Việt Nam”. Kết quả mong

đợi của đề tài sẽ giúp cho việc nghiên cứu đánh giá, quan trắc biến động các loài vi tảo độc hại,

cảnh báo các hiện tượng ô nhiễm môi trường biển (như thủy triều đỏ) trở nên thuận tiện, nhanh

chóng và hiệu quả hơn.

PHẦN 1. TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT FISH

1.1. Các bƣớc cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ - FISH

Sự ra đời của kỹ thuật FISH dựa trên các cải tiến của kỹ thuật ISH đã ra đời và là sự kết

hợp chính xác của phép lai một đoạn oligonucleotit (đầu dò) có gắn tín hiệu huỳnh quang với

một trình tự ADN đích đặc trưng. Bằng quan sát trực quan từ kính hiển vi huỳnh quang, các

phân tử huỳnh quang phát sáng với những màu sinh động cho phép hiển thị các đoạn ADN,

nhiễm sắc thể hay tế bào đích. Nhờ đó mà các nhà nghiên cứu có thể nhận dạng, liệt kê và định

vị các tế bào sinh vật trong mẫu môi trường tự nhiên hay trong các mô bệnh phẩm...

Quy trình này bao gồm các bước cơ bản sau:

- Bước 1: Chuẩn bị mẫu và đầu dò có trình tự nucleotit bổ sung đặc hiệu với trình tự đặc hiệu

cần nhận biết.

- Bước 2: Cố định mẫu nghiên cứu.

- Bước 3: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào của mẫu.

- Bước 4: Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai (đầu dò tự do).

- Bước 5: Hiển thị, quan sát và phân tích kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang.

1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam

Cho đến nay, tại Việt Nam, kỹ thuật FISH chủ yếu được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh

vực y học. Một số nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật FISH đã

được tiến hành. Các nghiên cứu này được dựa trên các trình tự ADN đích thuộc các nhiễm sắc

thể nhằm phát hiện một cách chính xác các bất thường trên các nhiễm sắc thể (NST) tương ứng

với các bệnh di truyền được quan tâm (Đặng Thị Hồng Nhung và cộng sự, 2008). Trong một

số nghiên cứu khác, ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang được dùng để chẩn đoán trước

sinh hội chứng Đao, hội chứng Tớc-nơ cũng đã cho kết quả thành công. Kết quả nghiên cứu

cũng cho thấy, việc sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đã cho kết quả rất chính xác khi

so sánh với phương pháp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối (Trần Thị Thu Hương và cộng

sự, 2005; 2006). Bên cạnh đó, các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong việc phát hiện các

lệch bội nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y từ tế bào dịch ối bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại

chỗ cũng đã thành công. Trên cơ sở phân tích các mẫu thu từ các phụ nữ mang thai giai đoạn

17 - 25 tuần có nguy cơ cao bị dị tật, kỹ thuật FISH đã giúp phát hiện 1 trường hợp mắc hội

chứng Patau (trisomy 13), 1 trường hợp mắc hội chứng Đao (trisomy 21), 1 trường hợp bất

thường cánh dài của NST 16. Kết quả cũng cho thấy 100% mẫu kết quả FISH phù hợp với kết

quả phân tích về NST liên quan đến các NST số 13, 18, 21, X, Y. Quy trình chuẩn nhằm chẩn

đoán trước sinh bằng chọc ối làm xét nghiệm FISH an toàn cũng đã được hoàn thiện (Nguyễn

Thị Tân Sinh và cộng sự, 2011). Sử dụng kỹ thuật FISH nhằm phát hiện sự khuếch đại gen

NMYC trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đã được tiến hành tại các bệnh viện Nhi

trung ương và cho kết quả tốt đẹp. Một số biến đổi di truyền trong u nguyên bào thần kinh có ý

nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh, trong đó sự khuếch

đại gen NMYC được xem là yếu tố quan trọng nhất đã được tìm thấy. Kết quả thành công này

có ý nghĩa quan trọng hỗ trợ các bác sỹ lâm sàng trong việc phân nhóm bệnh nhân và lựa chọn

phác đồ điều trị thích hợp (Vũ Đình Quang và cộng sự, 2010).

Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH đối với các loài sinh vật

thủy sinh tại Việt Nam gần như rất ít. Trong một nghiên cứu gần đây tại Viện nghiên cứu hải

sản về ứng dụng kỹ thuật FISH cho việc nhận diện nhanh 2 loài tảo giáp độc hại A. tamarense

và A. catenella, một số thử nghiệm đã được tiến hành. Các trình tự đích thuộc vùng D1- D2

trên nhiễm sắc thể mã hóa cho tiều phần lớn LSU của ribosome của loài được lấy làm cơ sở

thiết kế đầu dò. Tín hiệu huỳnh quang FITC được thiết kế gắn với đầu dò đặc hiệu. Kết quả

nghiên cứu đã cho thấy các trùng lặp, giống nhau về đặc điểm hình thái của các loài tảo giáp

từng gây khó khăn trong quan trắc tảo độc hại đã phần nào được giải quyết nhờ kỹ thuật FISH.

Đây cũng là một trong những cơ sở ban đầu cho việc ứng dụng kỹ thuật này trong quan trắc

cảnh báo về sự bùng phát các đối tượng thủy sinh gây thủy triều đỏ tại Việt Nam (Nguyễn Văn

Nguyên và cộng sự, 2011).

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm thu mẫu và đối tƣợng nghiên cứu

Hai mẫu tảo độc hại được thu tại vùng biển Cát Bà – Hải Phòng, gồm có:

+ Mẫu A. sp6 (Alexandrium affine) được thu vào ngày 20/7/2010 tại khu vực cửa biển

thuộc Bến Bèo (Cát Bà, Hải Phòng) với điều kiện môi trường như sau: độ mặn nước biển:

27‰, pH 7,72.

+ Mẫu A. sp7 (Alexandrium pseudogonyaulax) được thu vào ngày 27/4/2011 tại khu

vực vịnh cảng Cát Bà (Hải Phòng) với các điều kiện môi trường nước biển như sau: độ mặn

nước biển: 29‰, pH 7,44.

2.2. Phƣơng pháp thu và lƣu giữ mẫu

Mẫu được thu bằng lưới thu thực vật phù du có đường kính 20cm, kích thước mắt lưới

20µm, thu theo phương thẳng đứng. Mẫu sau đó được bảo quản trong lọ và giữ trong điều kiện

nhiệt độ từ 4 – 15^oC. Mẫu này sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập

(Hallegraeff và cộng sự, 1995; Anderson, 1995).

2.3. Phân lập các chủng vi tảo

Theo phương pháp thu tế bào đơn lẻ bằng micropipet của Richmon (2004) và Andersen

(2005): Môi trường nuôi được sử dụng là môi trường IMK (Daigo IMK – mua từ hãng Nihon

Pharmaceutical Co., Ltd.) dành cho nhóm tảo giáp (Alexandrium).

2.4. Phƣơng pháp nuôi giữ các chủng vi tảo biển

Theo Shoko và cộng sự (2005); Nguyễn Văn Nguyên và cộng sự (2011):

-

Cường độ chiếu sáng: 2.500 lux, bằng hệ thống ánh sáng trắng (đèn neon);

Chế độ chiếu sáng: 13h sáng liên tục/11h tối liên tục, được điều khiển bởi đồng hồ đóng

ngắt tự động;

-

Nhiệt độ nuôi: ổn định ở 24^oC liên tục trong buồng có điều hòa nhiệt độ;

Môi trường nuôi: IMK.

2.5.

Phƣơng pháp phân loại hình thái

Phân loại các mẫu tảo giáp được thực hiện chủ yếu dựa vào công thức tấm vỏ tế bào đã

được nhuộm Calco - fluor, quan sát dưới kính hiển vi quang học. Các tài liệu chính để phân loại

là: Balech (1995), Abe (1967a,b), Larsen và cộng sự (2004).

2.6.

Phƣơng pháp chuẩn bị ADN khuôn cho PCR

Các ống mẫu chứa tế bào được sốc nhiệt qua lại 3 lần giữa -20^oC và 90^oC trong thời

gian mỗi 20 giây ở mỗi điều kiện, nhằm làm vỡ tế bào và dung giải ADN ra ngoài. Các mẫu

được lắc rung (votex) và ly tâm trở lại (5.000vòng/phút) chuẩn bị cho phản ứng PCR (Sebastián

và cộng sự (2001).

2.7.

Phƣơng pháp Singel cell PCR

Theo Sebastián và cộng sự (2001); Shoko và cộng sự (2005): Phản ứng PCR được tiến

hành 2 lần để nhân vùng D1 – D2 của gen mã hóa tiểu đơn vị lớn 28s ARN ribosome. Cặp mồi

dùng cho PCR lần 1: S1R (5’-TACCTGG TTGATCCTG CCAG-3’) và 28-1483R (5’-

GCTACTACCACCAAGATCTGC-3’). Cặp mồi dùng cho PCR lần 2 là: D1R (5’-

ACCCGCTGAATTTAAGCATA-3’) và D2C (5’-CCTT GGTCCGTTTCAAGA-3’).

2.8.

Phƣơng pháp kiểm tra phân loại bằng ADN

Giải trình tự ADN vùng D1-D2 trên máy Applied Biosystems 3130 Series. Xây dựng

cây phát sinh chủng loại theo phương pháp kết nối lân cận (neighbor joining) sử dụng thuật

toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1000 lần. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên phần

mềm Mega phiên bản 5.03.

2.9.

Phƣơng pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu

Sử dụng công cụ ClustalW, phần mềm BioEdit để sắp xếp, so sánh các trình tự nucleotit

thu được với trình tự của những loài gần gũi về mặt phân loại. Trên cơ sở đó, lựa chọn đoạn

ADN đặc trưng nhất cho loài để thiết kế đầu dò. Đầu dò được chế tạo với yêu cầu gắn thêm

chất phát huỳnh quang fluorescein isothiocyanate (FITC) ở đầu 5’ hiển thị sự hiện diện của

trình tự đặc trưng.

2.10. Phƣơng pháp lai huỳnh quang tại chỗ (dựa theo phương pháp của Shoko và cộng sự

(2005)):

 Mẫu được đưa vào ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1 phút ở 4^oC).

 Cố định tế bào bằng 1ml dung dịch PBS (5x). Ly tâm thu mẫu và loại nước trong mẫu

lần lượt bằng dung dịch ethanol 50% và 80%. Ly tâm thu tế bào, lai với đầu dò trong

dung dịch Formamide (40%), SSC (5x) ở các thang nhiệt độ khác nhau: 37°C, 40°C,

43°C, 46°C, 49°C, 52°C trong 5 phút.

- Mẫu được rửa 2 lần trong SSC (5x).

Tế bào lai huỳnh quang sau đó được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang .

PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái

Trên cơ sở các mẫu thu được từ vùng biển Cát Bà, 2 chủng vi tảo độc hại đã được phân

lập, nuôi giữ và phân loại sơ bộ dựa trên các đặc điểm về hình thái. Hai loài tảo giáp được xác

định sơ bộ là thuộc chi Alexandrium bao gồm:

3.1.1. Loài Alexandrium affine

Hình dạng ngoài của tế bào (A); Tấm

1' với lỗ bụng và tổ hợp lỗ đỉnh (B, C); Tấm

S.a hình thang, không có phần phụ (D).

3.1.2. Loài A. pseudogonyaulax

Tấm 1’ hình 5 cạnh, không liên kết

với lỗ bụng và có 1 lỗ bụng lớn tròn tiếp

giáp với mép; ở một vài tế bào, lỗ bụng ở vị

trí tiếp giáp của các tấm 1’-4’6”

3.2. Ảnh hƣởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu

Trong điều kiện nuôi có độ mặn 30‰ (cường độ chiếu sáng 2500lux, chế độ chiếu sáng

13 giờ sáng: 11 giờ tối) loài A. affine phát triển tốt nhất trong các chế độ nuôi cấy. Đối với loài

A. pseudogonyaulax, kết quả thí nghiệm cho thấy, điều kiện về độ mặn thuận lợi nhất cho sự

sinh trưởng và phát triển của chúng với những điều kiện phòng thí nghiệm như đã nêu trên là ở

29‰.

3.3. Kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu

Ở mỗi mẫu thí nghiệm, đoạn mồi D1R, D2C đã nhân được một đoạn ADN duy nhất có

kích thước tương ứng với đoạn dự kiến. Vùng D1-D2 của mẫu L3 (xác định hình thái là A.

affine) có kích thước gồm 651bp. Đối với mẫu L4 (xác định hình thái là A. pseudogonyaulax),

vùng D1-D2 có trình tự bao gồm 650 bp. Kết quả phân tích BLAST 2 trình tự nói trên cũng đã

khẳng định hai loài này là A. affine và A. pseudogonyaulax.

3.4. Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang tại chỗ

Phần mềm Bioedit được sử dụng để sắp xếp, so sánh với các trình tự tham khảo (từ

NBCI) tại vùng tương đồng D1 - D2 của các loài thuộc chi Alexandrium. Những khác biệt từ

các trình tự bảo thủ này so với các loài khác là cơ sở cho việc chọn lọc trình tự phù hợp để thiết

kế đầu dò đặc hiệu cho từng loài. Kết quả sắp xếp và so sánh đối với loài A. affine tìm ra trình

tự nucleotit từ vị trí 657 đến 676 phù hợp để thiết kế đầu dò. Trình tự đầu dò cho loài A. affine

được xác định là: 5’-TGTAAGCTCTAGTAGGGTAG-3’. Tương tự như vậy, các kết quả so

sánh đối với trình tự đoạn D1 – D2 của loài A. pseudogonyaulax cũng tìm được trình tự 774

đến 794 phù hợp cho thiết kế đầu dò đặc trưng cho loài này. Trình tự đầu dò được xác định là:

5’-ACAGCTGACAATCGCAA TTG-3’.

Các trình tự này sau đó được đặt sản xuất bởi công ty TOS (Nhật Bản) với điều kiện có

gắn tín hiệu Fluorescein 5-isothiocyanate (FITC) vào đầu 5’ để phục vụ cho các thí nghiệm lai

huỳnh quang tiếp theo.

3.5. Tối ƣu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò

Trên cơ sở đầu dò thiết kế được, các thí nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ kiểm tra cho 2

loài A. affine và A. pseudogonyaulax đã được tiến hành. Kết quả thử nghiệm cho thấy, có sự

tương đối giống nhau về nhiệt độ lai lai đối với cả 2 đầu dò trên hai đối tượng vi tảo.

Đối với loài A. affine, nhiệt độ

lai phù hợp là 40°C và 43°C. Trong đó,

tín hiệu huỳnh quang thu được rõ nét

nhất ở tại 43°C.

Tương tự đối với loài A.

pseudogonyaulax, kết quả thử nghiệm

cũng đã cho thấy, đối với mẫu được lai

ở nhiệt độ 43°C cho kết quả tốt nhất,

hình ảnh sắc nét.

3.6.

Thử nghiệm đầu dò với các mẫu vi tảo thu ngoài tự nhiên

Nhằm hoàn thiện ứng dụng kỹ thuật này, thử nghiệm lai huỳnh quang với các mẫu thu

ngoài tự nhiên đã được tiến hành với nhiệt độ lai ở 43°C. Kết quả cho thấy, trong số 32 mẫu thu

từ biển Cát Bà, đầu dò cho loài A. affine đã phát hiện ra 17 mẫu có sự hiện diện của loài này

với mật độ tế bào khác nhau (Hình 3.11). Trong 15 mẫu còn lại, đầu dò không tìm được trình tự

đích nào. Trong khi đó, một số phân tích thành phần của mẫu thì chỉ thu được rất ít thành phần

loài của nhóm Alexandrium.

Lai đầu dò A. affine với

mẫu tự nhiên. Các mũi tên chỉ

các tế bào A. affine dưới ánh

sáng thường (trái) và được

phát hiện với màu xanh đặc

trưng (phải).

Lai

đầu

dò

A.

pseudogonyaulax với mẫu tự

nhiên. Các mũi tên chỉ các tế

bào A. pseudogonyaulax dưới

ánh sáng thường (trái)

và được phát hiện với màu

xanh đặc trưng (phải)

Quy trình lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) sử dụng đầu dò rARN có gắn tín hiệu FITC

đối với hai loài A. affine và A. pseudogonyaulax được tổng hợp lại và đề nghị như sau:

 Mẫu (5000-7000 tế bào/ml) được đưa vào ly tâm thu tế bào (3000vòng/phút trong 1

phút, 4^oC).

 Cố định tế bào bằng 1ml dung dịch PBS (5x) có chứa paraformandehyde (4%), để mẫu

trên đá lạnh trong 5 phút.

 Ly tâm mẫu 3000vòng/phút trong 1 phút (4^oC).

 Loại nước trong mẫu theo 2 bước:

- Thêm 1ml dung dịch ethanol 50% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào

(3000vòng/phút trong 1 phút, 4^oC).

- Thêm 1ml dung dịch ethanol 80% vào mẫu, ủ trên đá trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào

(3000vòng/phút trong 1 phút, 4^oC).

 Thêm 500µl dung dịch lai (gồm: Formamide (40%), SSC (5x), mẫu dò có gắn huỳnh

quang (50 pmol)).

 Lai tế bào ở 43°C trong 5 phút.

 Sau khi lai, mẫu được rửa 2 lần:

- Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50^oC trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào

(3000vòng/phút trong 1 phút, 4^oC).

-

Thêm 1ml SSC (5x) vào mẫu, ủ mẫu ở 50^oC trong 5 phút. Ly tâm thu tế bào

(3000vòng/phút trong 1 phút, 4^oC).

Sản phẩm lai huỳnh quang sau đó được quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang

(ECLIPSE E800, Nikon, Tokyo, Japan) với kính lọc sắc B-2A, bước sóng kích thích tín hiệu

FITC 490 nm, hiển thị và chụp ảnh tế bào bằng camera DS Nikon. Tổng thời gian thao tác cho

quá trình này đã được tính toán là khoảng 2,5 giờ. Điều này cho phép các thí nghiệm nghiên

cứu phát hiện các loài vi tảo biển độc hại chính xác, nhanh hơn nhiều so với các phương pháp

phân tích truyền thống bằng hình thái trước đây.

KẾT LUẬN

Chúng tôi đã rút ra được một số kết luận chính sau từ nghiên cứu này:

1. Đã xác định trình tự gen vùng mã hóa cho đoạn D1 – D2 của tiểu phần lớn (LSU) thuộc

ribosome của hai loài tảo giáp độc hại A. affine và A. pseudogonyaulax biển Việt Nam.

2. Đã thiết kế và thử nghiệm thành công hai đầu dò phân tử gắn tín hiệu huỳnh quang

FITC phục vụ cho ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đối với hai loài tảo độc A.

affine và A. pseudogonyaulax biển Việt Nam. Các đầu dò hoạt động tốt trên cả mẫu nuôi

cấy và mẫu thu ngoài tự nhiên và các đầu dò đảm bảo tính đặc hiệu của loài.

3. Đã ứng dụng thành công kỹ thuật FISH trong việc xác định nhanh chóng và chính xác 2

loài tảo độc hại biển Việt Nam nói trên, làm cơ sở cho việc ứng dụng phương pháp quan

trắc, đánh giá nhanh môi trường biển, nghiên cứu dự đoán diễn biến thủy triều đỏ tại các

vùng ven biển Việt Nam sau này.

KIẾN NGHỊ

Cần nghiên cứu và thiết kế thêm các đầu dò nhằm ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang

để nhận diện nhanh, nhiều loài tảo biển độc hại khác trong các vùng biển và ven biển Việt

Nam.

Cần có các nghiên cứu, ứng dụng các kỹ thuật di truyền trong việc quan trắc, phân loại

nhanh đối với các loài vi tảo biển Việt Nam nhằm có thể theo dõi thường xuyên, đánh giá

nhanh những biến đổi môi trường gây thủy triều đỏ do tảo biển độc hại gây ra, hạn chế thiệt hại

trong nuôi trồng thủy sản ven biển.

References

Tài liệu tiếng Việt

1. Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường (2005), “Ứng

dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để chẩn đoán trước sinh hội chứng down”, Tạp chí y học

thực hành, 11, tr. 9-11.

2. Trần Thị Thu Hương, Hoàng Thu Lan, Trần Thị Ngọc Lan, Trịnh Đức Cường, Nguyễn Thị

Quỳnh Thơ (2006), “Chẩn đoán trước sinh hội chứng Down, hội chứng Turner bằng kỹ thuật

lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp phân tích nhiễm sắc thể của tế bào ối”, Tạp chí nghiên cứu y

học, 1, tr. 4-8.

3. Nguyễn Văn Nguyên, Lê Thanh Tùng, Lưu Xuân Hòa, Vũ Tuấn Nam, Vũ Minh Hào, Đinh

Thái Bình (2011), “Thử nghiệm kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ F.I.S.H nhận diện nhanh và

chuẩn xác một số loài tảo giáp độc hại”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học và công nghệ

biển toàn quốc lần thứ V, Quyển 4 - Sinh học và nguồn lợi biển, tr. 261-268.

4. Đặng Thị Hồng Nhung, Nguyễn Duy Ngọc (2008), “Áp dụng kỹ thuật huỳnh quang tại chỗ

trong phát hiện bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể tại Bệnh viện Nhi Trung ương”, Tạp chí

nghiên cứu y học, 57, tr. 57-62.

5. Vũ Đình Quang, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Thị Phương Mai, Đinh Thị Hồng Nhung, Phùng

Tuyết Lan, Trần Đức Hậu, Trần Ngọc Sơn, Nguyễn Thanh Liêm (2010), “Đánh giá sự khuếch

đại gen NMYC trên bệnh nhân Neuroblastoma”, Tạp chí Nhi khoa, 3 (3), tr. 358-363.

6. Nguyễn Thị Tân Sinh, Ngô Diễm Ngọc, An Thuỳ Lan, Đinh Thị Hồng Nhung, Lê Thị Liễu,

Nguyễn Thanh Liêm (2011), “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoán

trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp”, Tạp chí Y học lâm sàng, số đặc biệt, tháng

2, tr. 253-258.

7. Chu Văn Thuộc (2002), “Nghiên cứu thành phần loài, phân bố và thăm dò khả năng gây hại

của một số loài tảo độc hại (harmful algae) thuộc ngành tảo giáp (Dinophyta) ở vùng cửa sông,

ven biển miền Bắc Việt Nam”, Luận án tiến sĩ ngành sinh học, Viện nghiên cứu hải sản.

Tài liệu tiếng Anh

8. Abé, T. H. (1967a), “The armoured Dinoflagellata: II. Prorocentridae and Dinophysidae

(A)”, Publ. Seto Mar. Biol., 14(5), pp. 369 - 389.

9. Abé, T. H. (1967b), “The armoured Dinoflagellata: II. Prorocentridae and Dinophysidae (B),

Dinophysis and its allied genera”, Publ. Seto Mar. Biol., 15(1), pp. 37 - 78.

10. Adachi M., Sako Y., Ishida Y. (1996), “Analysis of Alexandrium (Dinophyceae) species

using sequences of the 5,8S ribosomal DNA and internal transcribed spacer regions”. J. Phycol,

32, pp. 424–432.

11. Alfreider A., Pernthaler J., Amann R., Sattler B., Glöckner F. O., Wille A., and Psenner R.

(1996), “Community analysis of the bacterial assemblages in he winter cover and pelagic layers

of a high mountain lake by in situ hybridization”, Appl. Environ. Microbiol, 62, pp: 2138 -

2144.

12. Amann R., Fuchs B. M., Beherens S. (2001), “The identification of microorganisms by

fluorescence in situ hybridization”, Curr. Opin. Biotechnol., 12, pp. 231 – 236.

13. Andersen, G. (2005), “Traditional Microalgae Isolation Techniques, Algal cuturing

techniques”, Phycologycal society of America, 578p.

14. Anderson, P. (1996), “Design and implementation of some harmful agal monitoring

system”, IOC Technical Series, 44, UNESCO

15. Anderson, D.M. (1995), “Identiﬁcation of harmful algal species using molecular probes, an

emerging technology”, Harmful Marine Algal Blooms, Lavoiser Science Publishers, pp. 3–13.

16. Balech, I. (1995), “The genus Alexandrium Halim (Dinoflagellata)”, Trans. Am.

Microscop. Soc., 113, pp. 216 - 220.

17. Baoyu Z., Guofu C., Guangce W., Douding L. (2010), “Identification of two Skeletonema

costatum-like diatoms by fluorescence in situ hybridization”. Chinese Journal of Oceanology

and Limnology, 28(2), pp. 310 - 314.

18. Benedetta B., Danilo E., Monica G., Erasmo N. (2006), “Application of FISH technology

for microbiological analysis: current state and prospects”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 73, pp.

485 – 494.

19. Bouvier T., Del G. (2003), “Factors influencing the detection of bacterial cells using

fluorescence in situ hybridization (FISH)”, FEMS Microbiol. Ecol., 44, pp. 3 – 15.

20. Cho E. S., Hur H. J., Byun H. S., Lee S. G., Rhodes L. L., Jeong C. S. and Park J.

G.(2002), “Monthly monitoring of domoic acid producer Pseudo-nitzschia multiseries (Hasle)

Hasle using species-specific DNA probes and WGA lectins and abundance of Pseudo-nitzschia

species (Bacillariophyceae) from Chinhae Bay”, Korea. Bot. Mar., 45, pp. 364 - 372.

21. Choi, B. K. (1994), “Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes from a

patient with severe destructive periodontitis”. Infect. Immun., 62, pp. 1889 – 1895.

22. Choong J. K., Yoshihiko S. (2005), “Molecular identiﬁcation of toxic Alexandrium

tamiyavanichii (Dinophyceae) using two DNA probes”, Harmful Algae, 4, pp. 984 - 991.

23. Deere, D. (1998), “Evaluation of fluorochromes for flow cytometric detection of

Cryptosporidium parvum oocysts labelled by fluorescence in situ hybridization”, Lett. Appl.

Microbiol., 27, pp. 352 – 356.

24. DeLong, E. F. (1989), “Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the

identification of single microbial cells”, Science, 243, pp. 1360 –1363.

25. DeLong E. F., Taylor L. T., Marsh T. L. and Preston C. M. (1999), “Visualization and

enumeration of mMarine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes

and fluorescent in situ hybridization”, Applied and Environmental Microbiology, 65, pp. 5554

- 5563.

26. Felske, A. (1998), “In situ detection of an uncultured predominant Bacillus in dutch

grassland soils”, Appl. Environ. Microbiol., 64, pp. 4588 – 4590.

27. Fuchs B. M., Syutsubo K., Ludwig W., Amann R. (2000), “In situ accessibility of

Escherichia coli 23S rRNA to fluorescently labeled oligonucleotide probes”, Appl. Environ.

Microbiol., 67, pp. 961 – 968.

28. Gersdorf H. (1993a), “Identification of bacteroides forsythus in subgingival plaque from

patients with advanced periodontitis”, J. Clin. Microbiol., 31, pp. 941 – 946.

29. Gersdorf, H. (1993b), “Fluorescence in situ hybridization for direct visualization of Gram-

negative an aerobes in subgingival plaque samples”, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 6, pp.

109 – 114.

30. Glockner, F. O. (1996), “An in situ hybridization protocol for detection and identification

of planctonic bacteria”, Syst. Appl. Microbiol., 19, pp. 403 – 406.

31. Glöckner F. O., Fuchs B. M. and Amann R. (1999), “Bacterioplankton compositions of

lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization”, Appl.

Environ. Microbiol., 65, pp. 3721 - 3726.Hallegraeff G. M., Anderson D. M., Cembella A. D.,

Enevoldsen H. O. (1995), “Manual on harmful marine microalgae, IOC Manual and Guides”,

UNESCO, 33, 794p.

33. Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of

bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J. Clin. Microbiol., 38, pp.

818 – 825.

34. Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of

bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J. Clin. Microbiol. 38, pp.

818 – 825.

35. Hougaard D. M., Hansen H. and Larsson L. I. (1997), “Non-radioactive in situ

hybridization for mRNA with emphasis on the use of oligodeoxynucleotide probes”,

Histochem. Cell Biol., 108, pp. 335 - 344.

36. Inacio J., Beherens S., Fuchs B. M., Fonseca A., Spencer M. I., Amann R. (2003), “In situ

accessibility of Saccharomyces cerevisiae 26S rRNA to Cy3-labeled oligonucleotide probes

comprising the D1 and D2 domains”, Appl. Environ. Microbiol., 69, pp. 2899 – 2905.

37. Jansen, G. J. (2000), “Rapid identification of bacteria in blood cultures by using

fluorescently labeled oligonucleotide probes”, J. Clin. Microbiol., 38, pp. 814 – 817.

38. Jeffrey M. L. and Robert H. S. (2003), “Fluorescence in situ hybridization: past, present

and future”, Journal of Cell Science, 116, pp. 2833 – 2838.

39. Johannes Z., Wolfgang L., Karl H. S. (2001), “DNA polynucleotide probes generated from

representatives of the genus acinetobacter and their application in fluorescence in situ

hybridization of environmental samples”, System. Appl. Microbiol., 24, pp. 238 – 244.

40. Kagiyama, N. (1993), “A novel fluorescent method for in situ hybridization”, Acta

Histochem. Cytochem., 26, pp. 441 – 445.

41. Kempf, V. A. (2000), “Fluorescent in situ hybridization allows rapid identification of

microorganisms in blood cultures”, J. Clin. Microbiol., 38, pp. 830 – 838.

42. Kenzaka, T. (1998), “rRNA targeted fluorescent in situ hybridization analysis of bacterial

community structure in river water”, Microbiology, 144, pp. 2085 – 2093.

43. Kim C. J., Kim C. H., Sako Y. (2005), “Development of molecular identiﬁcation method

for genus Alexandrium (Dinophyceae) using whole-cell FISH”, Marine Biotechnology, 7, pp.

215 – 222.

44. Langendijk P. S, Schut F., Jansen G. J., Raangs G. C., Kamphuis G. R., Wilkinson M. H.

F., Welling G. W. (1995), “Quantitative fluorescence in situ hybridization of Bifidobacterium

spp. with genus-specific 16S rRNA-targeted probes and its application in faecal samples”,

Appl. Environ. Microbiol., 61, pp. 3069 – 3075.

45. Larsen J. and Nguyen N. L. (2004), “Potentially toxic microalgae of Vietnamese waters”,

Opera Botanica, 140, 216p.

46. Llobet B., Rosselló M., and Amann R. (1998), “Microbial community composition of

wadden sea sediments as revealed by fluorescence in situ hybridization”, Appl. Environ.

Microbiol., 64, pp. 2691 - 2696.

47. Manuelidis L., Langer P. R. and Ward D. C. (1982), “High-resolution mapping of satellite

DNA using biotin-labeled DNA probes”, J. Cell Biol., 95, pp. 619 - 625.

48. Michael H., Ralph W., Georg H., Jutta F., Andrea W., Alexander R., Eberhard S., Siegfried

J., Christoph C. (2003), “COMBO-FISH: specific labeling of nondenatured chromatin targets

by computer-selected DNA oligonucleotide probe combinations”, BioTechniques, 35(3), pp.

564 – 577.

49. Miller P. E., Scholin C. A. (2000), “On detection of Pseudo-nitzschia

(Bacillariophyceae) species using whole cell hybridization: sample fixation and stability”, J.

Phycol., 36, pp. 238 – 250.

50. Miller P. E., Scholin C. A. (1996), “Identification of cultured Pseudonitzschia

(Bacillariophyceae) using species-specific LSU rRNAtargeted fluorescent probes”, J. Phycol.,

32, pp. 646 – 655.

51. Miller P. E., Scholin C. A. (1998), “Identification and enumeration of cultured and wild

Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) using species-specific LSU rRNA-targeted fluorescent

probes and filter-based whole cell hybridization”, J. Phycol., 34, pp. 371 – 382.

52. Moter, A. (1998), “Molecular epidemiology of oral treponemes associated with periodontal

disease”, J. Clin. Microbiol., 36, pp. 1399 – 1403.

53. Niels B. R., Henrik F., Timothy G. F., Finn A., Bo T. (1996), “Distribution of bacterial

populations in a stratified fjord (Mariager Fjord, Denmark) quantified by in situ hybridization

and related to chemical gradients in the water column”, Appl. Environ. Microbiol., 62, pp. 1391

– 1404.

54. Pardue, M. L. (1969), “Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of

cytological preparations”, Proc. Natl. Acad. Sci., 64, pp. 600 –604.

55. Pernthaler J., Glöckner F. O., Schönhuber W., and Amann. R. (2001), “Fluorescence in

situ hybridization (FISH) with rRNA-targeted oligonucleotide probes”,

Microbiology: Marine Microbiology, 30, pp. 207 – 210.

Methods in

56. Puvion D., and Puvion E., (1996), “Non-isotopic electron microscope in situ hybridization

for studying the functional sub-compartmentalization of the cell nucleus”, Histochem. Cell

Biol., 106, pp. 59 - 78.

57. Richmon, A. (2004), “Handbook of Microalgal culture: Biotechnology and Applied

Phycology”, Blackwell Science, 577p.

58. Rudkin G. T., and Stollar B. D. (1977), “High resolution detection of DNA-RNA hybrids

in situ by indirect immunoﬂuorescence”, Nature, 265, pp. 472-473.

59. Scholin C., Miller P. E., Buck K., Chavez F., Harris P., Haydock P., Howard J. (1997),

“Detection and quantification of Pseudo-nitzschia australis in cultured and natural populations

using LSU rRNA-targeted probes”, Limnol. Oceanogr. 42(5), pp. 1265 –1272.

60. Shoko H. T., Sako Y. (2005), “Rapid detection of natural cells of Alexandrium tamarense

and A. catenella (Dinophyceae) by fluorescence in situ hybridization”, Harmful Algae, 4, pp.

319 – 328.

61. Singer R. H., and Ward D. C. (1982), “Actin gene expression visualized in chicken muscle

tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog”, Proc. Natl.

Acad. Sci., 79, pp. 7331 - 7335.

62. Sebatián C. R., and Ryan C. O’. (2001), “Single-cell sequencing of dinoflagellate

(Dinophyceae) nuclear ribosomal genes”, Molecular Ecology Resources, 1(4), pp. 329-331.

63. Tanabe S. H., Sako Y. (2006), “Development and application of ﬂuorescence in situ

hybridization (FISH) method for simple and rapid identiﬁcation of the toxic dinoﬂagellates

Alexandrium tamarense and Alexandrium catenella in cultured and natural seawater”,

Fishersies science, 72(1), pp. 77 - 82.

64. Trebesius K., Amann R., Ludwig W., Mühlegger K., and Schleifer K. (1994),“

Identification of whole fixed bacterial cells with nonradioactive 23S rRNA-targeted

polynucleotide probes”, Appl. Environ. Microbiol. 60, pp. 3228 - 3235.

65. Wagner M., Schmid S. J., Trebesius K., Bubert A., Goebel W., and Schleifer K. (1998),

“In situ detection of a virulence factor mRNA and 16s rRNA in Listeria monocytogenes”,

FEMS Microbiology Letters, 160, pp. 159 - 168.

66. Werner M., Rudolf A., Wolfgang L., Marc V., and Karl H. S. (1996), “Application of a

suite of 16s rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the

phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment”, Microbiology, 142, pp.

1097 – 1106.

67. Yamaguchi, N. (1996). “Detection of specific bacterial cells with 2-hydroxy-3-naphthoic

acid-29-phenylanilide phosphate and Fast Red TR in situ hybridization”, Appl. Environ.

Microbiol., 62, pp. 275–278.

68. Ylmaz L. S., Hatice E. O., Noguera D. R. (2005), “Making all parts of the 16S rRNA of

Escherichia coli accessible in situ to single DNA oligonucleotides”, Appl. Environ.

Microbiol., 72, pp. 733 – 744.

69. Zarda, B. (1991), “Identification of single bacterial cells using digoxigeninlabelled,

rRNA-targeted oligonucleotides”, J. Gen. Microbiol., 137, pp. 2823 – 2830.