Tài liệu Giới thiệu về kĩ thuật Fish

A./ GIỚI THIỆU VỀ KĨ THUẬT FISH.

FISH là một kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế

bào vi khuẩn. FISH không chỉ cho phép nhận ra các vi sinh vật quen thuộc, đã biết

môi trường nuôi cấy đặc hiệu mà còn xác định được các vi sinh vật lạ, chưa biết rõ

về điều kiện và môi trường nuôi cấy, do đó FISH có thể giúp chúng ta biết rõ về hệ

thống phức tạp của các quần thể vi sinh vật. FISH kết hợp sự chính xác của các kỹ

thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình

dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô

bệnh. Độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở

thành công cụng hiến cứu hữu hiệu nhất.

Trên thế giới, FISH được sử dụng trong việc mô tả quần thể vi sinh vật trong môi

trường tự nhiên, nổi bật là hệ vi sinh vật ở trầm tích biển Wadden, tại vịnh hẹp ở

Na-uy, sinh vật phù du ở sông hoặc biển, tuyết hồ trên núi cao, trong đất và trên bề

mặt rễ thực vật. FISH đặc biệt phổ biến trong y học, ngoài mục đích xác định các

mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, các bệnh

lây qua đường máu, ung thư…) FISH còn được sử dụng để chẩn đoán thường qui

sự bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể (trước sinh và sau sinh) của

thai nhi.

Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng

trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật

này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và

chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển.

B. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH

I. QUY TRÌNH THỰC HIỆN.

1.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH

FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vi sinh vật

mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với

các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần

phá vỡ tế bào).

Quy trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản sau:

- Chuẩn bị mẫu và đầu dò.

- Cố định mẫu.

- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào.

- Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai.

- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang

trực tiếp).

- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả.

Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH

1.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang

Lựa chọn đầu dò: Như đã được đề cập từ trước, các trình tự đích được sử dụng

phổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng

bản sao nhiều và cấu trúc được bán bảo tồn. Các đầu dò oligonucleotide ứng với

mỗi cấp độ phân loại, giữa các loài vi khuẩn nhân thật hay khuẩn cổ, cho đến các

chi và loài cụ thể đều có thể thiết kế được dựa theo kích thước của rRNA đích

Với sự tăng lên nhanh chóng của các đoạn thông tin di truyền trong các cơ

sở dữ liệu chung và thương mại, đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận

biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác. Điều này đặc

biệt có ý nghĩa khi tiến hành phân lập hỗn hợp vi khuẩn tạp hay các sinh vật chưa

từng nuôi cấy đặc hiệu. Số lượng lớn các bản sao rRNA 16S trong mỗi lần sao

chép và trong các quá trình hoạt động trao đổi chất của tế bào luôn cung cấp đủ số

lượng các trình tự đích để hiển thị được các dòng tế bào cụ thể, ngay cả các

oligonucleotide chỉ gắn một nhãn huỳnh quang trong thí nghiệm FISH. Việc lựa

chọn vị trí trình tự đích và quá trình thiết kế đầu dò phải được tiến hành với sự thận

trọng cao nhất. Gần đây, các trình tự đích khác như rRNA 23S, rRNA 18S mà gần

đây là mRNA cũng đã được xác định thành công bởi thí nghiệm FISH.

Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng trong FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độ

nhạy và khả năng xâm nhập vào tế bào. Một đầu dò oligonucleotide điển hình

thì có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, được tạo ra bằng một thiết bị tổng hợp tự

động. Các đầu dò ngắn thì dễ dàng tiếp cận được với trình tự đích, nhưng chúng lại

mang được ít các trình tự đánh dấu. Trong FISH, các trình tự đích thông dụng nhất

là rRNA 16S bởi vì chúng ổn định về mặt di truyền, cấu trúc được bán bảo tồn, và

số lượng các bản sao nhiều. Do đó, các đầu dò được lựa chọn thường là các

oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất

trong quá trình lai. Các đầu dò oligonucleotide huỳnh quang ngày nay đã có một số

sản phẩm được thương mại hóa. Chúng có thể lưu trữ được ở-20^OC trong tối

khoảng vài tháng.

Có nhiều cách để đánh dấu đầu dò, đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang

lên đầu dò là cách thông dụng nhất, nhanh nhất, rẻ nhất và dễ dàng thực hiện nhất

bởi vì chúng không đòi hỏi phải tiến hành các bước dò tìm sau quá trình lai. Một

hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp với

oligonucleotide trong suốt quá trình tổng hợp thông qua liên kết amino ở đầu 5’

của đầu dò, hoặc sử dụng enzyme Terminal transferase để gắn các

nucleotide có đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ của đầu dò . Ngoài ra, một số

thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate (FITC) nếu được gắn vào

oligonucleotide theo một dải đệm 18 carbon thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu

so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp .Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh

quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn nhãn chất huỳnh quang

trên cả hai đầu, một phân tử ở đầu 3’ và 4 phân tử ở đầu 5’ được sử dụng như

những miếng đệm thích hợp để ngăn chặn sự che khuất lẫn nhau của các tín hiệu

huỳnh quang.

Trong một số trường hợp, việc dò tìm theo cách gián tiếp thì có hiệu quả hơn.

Người ta thấy rằng, có thể tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH lên bằng cách kết

hợp các đầu dò với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG), sau đó chúng sẽ

được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang . Độ nhạy của FISH còn có thể

được tăng lên đáng kể khi sử dụng enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu.

Phương pháp này được phát triển bởi Kagiyama và cộng sự (1993) khi nghiên cứu

về di truyền học tế bào, sau đó được Yamaguchi và cộng sự thay đổi để áp dụng

vào định danh vi khuẩn (1996). Ban đầu, mỗi oligonucleotide vẫn sẽ được đánh

dấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dò tìm bằng một thể kháng

digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với enzyme phosphatase kiềm.

Enzyme này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide

phosphate) thành dạng Dephosphoryl, thểnày tạo ra màu huỳnh quang đỏ sáng khi

kết hợp với Fast Red TR. Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách thực hiện này

có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotide chỉ gắn nhãn

huỳnh quang duy nhất. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng

được cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín

hiệu Tyramide” (TSA) . Hệ thống TSA làm tăng cường độ tín hiệu lên

khoảng 10 – 20 lần. Tuy nhiên, số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi

một cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dò thông thường được đánh dấu duy nhất

một chất huỳnh quang. Điều này xảy ra là do quá trình xâm nhập của các chất cao

phân tử bào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường.

Mặc dù enzyme lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu dò vào trong tế

bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường như

không áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương, do đó phương pháp

này chủ yếu được dùng để phân tích các quần thể vi khuẩn tạp.

Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) và (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c),

TSA (d) hay đầu dò polyribonucleotide (e)(Moter et al., 2000).

Có lẽ phương pháp hiệu quả nhất là kết hợp việc sử dụng các đầu dò

polyribonucleotide, được đánh dấu với digoxygenin, đồng thời sử dụng hệ thống

khuyếch đại tín hiệu tyramide (TSA). Kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công

khi dò tìm và phát hiện trực quan các độc tố trong Listeria(Hình 2e) .

Lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang: Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang

đều có các mức năng lượng kích thích và phát xạ tối đa khác nhau nên cho phép

phát hiện đồng thời hai hoặc nhiều vi sinh vật khi chỉlai một lần duy nhất. Cùng

với việc quan sát trực quan bằng kính hiển vi đa màu FISH, các bộ lọc màng nhiều

dải cũng có thể được sử dụng. Các chất huỳnh quang tổng hợp có những điểm phát

xạ sắc nét khác nhau nên sẽ loại bỏ được hiện tượng các phổ huỳnh quang chồng

lên nhau giữa các đầu dò, đồng thời hạn chế các vấn đề về màu nền và sự dây,

nhem màu. Chất màu huỳnh quang có màu sáng nhất và bền quang học nhất nên sử

dụng để dò tìm các trình tự đích mà lượng mẫu rất ít.

Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dò tìm vi sinh vật bằng phương

pháp FISH

Bước sóng có thể thay đổi ít nhiều tùy thuộc vào nhà sản xuất. Quang phổ phát

xạ có thể thay đổi trong các dung môi khác nhau hoặc đặc tính của mẫu.

*FITC : Fluorescein–isothiocyanate

**FluoXE : 5-(-6-)carboxyfluorescein–N-hydroxysuccimideester

***TRITC : Tetramethyl–rhodamine–isothiocyanate

1.3. Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ

Trước khi tiến hành lai, mẫu chứa vi sinh vật và các đầu dò phải được ngâm

trong các hợp chất tạo tủa như ethanol hoặc methanol, hợp chất tạo được liên kết

ngang như aldehyde hoặc hỗn hợp các chất trên để các đầu dò huỳnh quang có thể

thấm vào bên trong tế bào và bảo vệ các rRNA không bị biến tính bởi các RNAse

nội bào. Các điều kiện và phương pháp cố định mẫu có thể khác nhau tùy thuộc

vào vi sinh vật đích và loại mẫu. Quá trình cố định mẫu tối ưu sẽ đưa được số

lượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng các trình tự đích

RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng. Cố định

đầu dò vào mẫu hiệu quả sẽ ảnh hưởng rất tích cực đến kết quả của FISH, nhưng

việc cố định rất khó để có thể tối ưu hóa. Thông thường một lượng dung dịch

formaldehyde hoặc paraformaldehyde 3-4% (v/v) thì phù hợp cho hầu hết các loại

vi khuẩn Gram âm. Đối với các vi khuẩn Gram dương, sử dụng ethanol (50%), hỗn

hợp ethanol/formalin (tỉlệ9:1 v/v) hoặc xử lý nhiệt là những biện pháp thông dụng

nhất; ngoài ra có thể bổ sung thêm bước xử lý sơ bộ để tăng tính thấm của đầu dò.

Khi áp dụng phương pháp FISH trên mẫu chứa nhiều đoạn mô khác nhau, các

quá trình tiền xử lý bắt buộc phải được áp dụng để tăng khả năng tiếp cận của các

đầu dò đối với các trình tự đích tương ứng, đồng thời hạn chế được các liên kết

không đặc hiệu. Gần đây, FISH đã được áp dụng trên các mẫu mô tế bào được

ngâm trong dung dịch keo lạnh. Trong các chất dẻo này, sự hiển thị của vi

khuẩn và sự bảo vệ cấu trúc của mô của các tế bào rất hoàn chỉnh mà không hề có

bất cứ quá trình tiền xử lý nào.

1.4. Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu

Trước khi tiến hành lai, các tế bào sau giai đoạn xử lý kể trên được cố định vào

một mặt kính. Để quá trình gắn mẫu vào mặt kính được tốt hơn, người ta khuyên

nên xử lý bề mặt kính trước bằng cách phủ lên mặt kính một lớp chất tráng kính

ngoài. Các hóa chất được sử dụng cho hiệu quả tốt là gelatin , poly-L-lysine hay

các hợp chất tạo muối.

Quá trình lai phải được thực hiện trong những điều kiện hết sức nghiêm ngặt

nhằm kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ

sung với chúng. Đối với thao tác quan trọng nhất trong thí nghiệm FISH, quá trình

làm nóng sơ bộ các phân tử lai phải được thực hiện để các đầu dò huỳnh quang kết

hợp bổ sung với các trình tự RNA đích tương ứng. Sự chính xác khi bắt cặp bổ

sung có thể được điều khiển bằng cách thay đổi nồng độ formamide hay nhiệt độ

của quá trình. Formamide sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy của phân tử bằng cách

làm suy yếu liên kết hydro, từ đó cho phép tiến hành quá trình nhuộm ở nhiệt độ

thấp những vẫn đảm bảo độ chính xác cao.

Quá trình lai xảy ra trong môi trường tối ẩm, nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50^oC.

Thời gian lai có thể kéo dài từ 30 phút đến vài giờ. Sau đó, rửa mẫu bằng nước cất

để loại bỏ các đầu dò không liên kết được với trình tự đích. Cuối cùng, rửa lại với

nước một lần nữa, sấy và cố định các phân tử lai, có thể bổ sung thêm các chất

chống phai màu.

1.5. Quan sát và xử lý tín hiệu

Để có thể quan sát được các tín hiệu huỳnh quang đa sắc trong thí nghiệm

FISH, kính hiển vi thông thường sẽ được trang bị thêm một bộ lọc dải hẹp nhiều

tần. Ngoài ra, để thu nhận và phân tích được các hình ảnh đó cần phải sử dụng một

máy ảnh CCD (charged coupled device) kết hợp với phần mềm phân tích xử lý ảnh

kỹ thuật số. Đây là hệ thống cảm biến chính xác nhất hiện nay và nó rất hữu dụng

khi quan sát những mẫu vi sinh vật quan trọng, những nơi có cường độ tín hiệu

thấp. Hệ thống này cũng đã được sử dụng để kiểm tra số lượng các tế bào vi sinh

vật và xác định hoạt tính các dòng tế bào đơn trong màng sinh học thông qua

việc xác định hàm lượng rRNA . Gần đây, phương pháp phân tích sự phân bố

không gian của vi khuẩn đã được cải tiến hơn nữa khi sử dụng kính hiển vi quan

sát huỳnh quang dải rộng. Một loại kính hiển vi khác được sử dụng cho thí

nghiệm FISH là kính hiển vi quét laze đồng tiêu (CLSM). Thông qua việc hạn chế

hệ thống tín hiệu trong những khoảng hẹp của đối tượng nghiên cứu, các tín hiệu

huỳnh quang bị lệch tiêu sẽ bị loại bỏ, tạo ra những hình ảnh rõ nét. Điều này rất

hữu dụng cho mẫu có độ phân bố dày đặc, như các lớp bùn, màng sinh học hay

đoạn mô.

.

Hình 4. Kính hiển vi quét laze đồng tiêu

II. NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI KỸ THUẬT FISH

2.1. Kết quả không chính xác

2.1.1. Các chất tự phát huỳnh quang

Khi gặp phải những chất có khả năng tự phát huỳnh quang, phương pháp FISH

sẽ có nhiều hạn chế. Vấn đề khó khăn nhất chính là khả năng tự phát huỳnh quang

của bản thân vi sinh vật. Những trở ngại này đều đã được kiểm chứng trên nhiều

loài nấm mốc hay nấm men khác nhau , trên một số loại vi khuẩn: Pseudomonas ,

Legionella , Rhodospirillum centenum, vi khuẩn lam và gần đây nhất là sự thí

nghiệm trên các loại vi khuẩn cổ như methanogenes đều thể hiện những phức tạp

của FISH khi phân tích môi trường vi sinh vật.

Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida

albicans(Moter et al., 2000)

2.1.2. Đầu dò thiếu tính đặc hiệu

Độ chính xác và độ tin cậy của FISH phụ thuộc nhiều vào tính đặc hiệu của các

đầu dò oligonucleotide. Thiết kế cẩn thận và đánh giá giới hạn của các đầu dò mới

là điều thiết yếu. Điều quan trọng cần lưu ý rằng mỗi một oligonucleotide chỉ phù

hợp với duy nhất một dữ liệu thông tin mà nó có chung nguồn gốc. Do sự báo cáo

thiếu chính xác thông tin của các trình tự và sự mở rộng nhanh chóng của cơ sở dữ

liệu, nên các trình tự đầu dò cần được kiểm tra một cách thường xuyên để cập

nhật các thông tin mới nhất. Khi phân lập các vi sinh vật khó nuôi cấy hoặc chưa

biết môi trường đặc hiệu, việc cập nhật thông tin các trình tự tỏ ra rất hữu ích để

kiểm tra tính đặc hiệu trước khi lai thử nghiệm như các phương pháp lai dot-blot

2.2. Kết quả âm tính

2.2.1. Số lượng đầu dò quá ít

Cường độ tín hiệu thấp có thể do sự thâm nhập không đủ của đầu dò vào bên

trong tế bào vi khuẩn. Các đầu dò polyribonucleotide khi thấm vào tế bào vi sinh

vật gram âm thường không gặp phải bất cứ vấn đề nhỏ nào. Đối với vi sinh vật

gram dương, đặc biệt là những đầu dò có trình tự dài hoặc trung bình thì sử dụng

các acid mycolic kết hợp với cố định đặc hiệu và tiền xử lý có thể rất cần thiết.

2.2.2. Những cấu trúc phức tạp của đầu dò hay trình tự đích

Do cấu trúc ba chiều của rRNA nên không phải tất cả các chuỗi trình tự đích

đều tiếp cận được với các đầu dò tương ứng. Cấu trúc vòng hoặc kẹp tóc cũng như

sự tương tác giữa rRNA và protein cản trở dẫn đến sự cảm biến khác nhau của các

đầu dò oligonucleotide. Điều này giải thích tại sao các đầu dò sử dụng tốt trong các

phương pháp lai thông thường có giai đoạn biến tính RNA hoặc DNA đã không

cho kết quả khả quan trong FISH. Một hệ thống nghiên cứu nhằm giải quyết

vấn đề này đã được công bố bởi Fuchs và cộng sự (1998). Các nhà nghiên cứu đã

tạo ra hơn 200 đầu dò oligonucleotide, xác định cụ thể những vị trí khác nhau trên

16S rRNA của E.coli, rồi sử dụng phương pháp flow cytometry đo cường độ tín

hiệu của chúng bằng thí nghiệm FISH. Dựa trên đầu dò phát sáng nhất, các

oligonucleotide được phân thành 6 mức độ sáng khác nhau và dựng sẵn một biểu

đồ thể hiện khả năng tiếp cận của 16S rRNA E.coli. Kể từ khi rRNA 16S được bảo

quản tốt hơn, biểu đồ này có thể đơn giản việc thiết kế đầu dò hợp lý không chỉ đối

với E.coli, mà còn cho tất cả các vi sinh vật khác. Tuy nhiên, theo một số nhà

nghiên cứu khác, đây là điều bắt buộc để đánh giá và tối ưu hóa thiết kế tất cả các

đầu dò tương ứng với các vi sinh vật và thích nghi với những ảnh hưởng tiêu cực

trước khi được áp dụng trên các mẫu hỗn tạp và chưa xác định được thành phần.

2.2.3. Hàm lượng rRNA thấp

Mặc dù thông thường rất phong phú, nhưng hàm lượng rRNA của các tếbào vi

khuẩn khác nhau rất đáng kể không chỉ giữa các loài, mà còn có sự khác nhau giữa

các tế bào của cùng một chủng tùy theo các đặc điểm sinh lý liên quan trực tiếp

đến tốc độ tăng trưởng của chúng

2.2.4. Ảnh chụp bị mất màu

Nhiều chất nhuộm huỳnh quang bị phai màu nhanh chóng theo sự kích thích

của bước sóng ánh sáng, dẫn đến không thể phục hồi những chỗ hư hỏng. Những

lần phơi sáng chỉ từ vài giây đến vài phút nhưng có ảnh hưởng rất quan trọng, đặc

biệt với ảnh chụp qua kính hiển vi. Để khắc phục những khó khăn này, việc sử

dụng bộ lọc dải hẹp, thuốc nhuộm cyanine bền quang học và các công cụ chống

III./ Biện pháp khắc phục

Sử dụng đầu dò vi khuẩn : Cách kiểm soát tốt nhất cho những kết quả bị âm

tính về khía cạnh phương pháp là sử dụng một đầu dò vi khuẩn. Nếu tiến hành lai

với một đầu dò phổ biến cho được kết quả khả quan trong FISH, thì việc cố định,

sự thẩm thấu và hàm lượng rRNA của vi khuẩn không còn là chỉ số hạn chế.

EUB338 là đầu dò thường được sử dụng cho mục đích này. Tuy nhiên, các

phân tích gần đây đã chỉ ra rằng một số ngành vi khuẩn bao gồm Planctomycetales

và Verhowrucomicrobia vẫn còn bị thiếu đầu dò này . Vì vậy, sử dụng một tập

hợp nhiều đầu dò vi khuẩn là điều rất cần thiết có một cái nhìn toàn diện hơn khi

phân tích các quần thểvi khuẩn phức tạp. Để kiểm soát những liên kết không đặc

hiệu giữa các đầu dò của vi khuẩn nhân thật với 16S rRNA đích hay với các thành

phần khác của tế bào so với acid nucleic, việc bổ sung đầu dò có tên là NON338

có thể được sử dụng và nó không phải đưa ra bất cứ tín hiệu nào trong FISH.

C. ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT FISH

1. Hệ vi sinh vật trong nước thải

Ardern và Lockett (1914) đã phát triển hệ thống hoạt hóa bùn đầu tiên để thanh

lọc nước thải tại Manchester. Tuy nhiên, vai trò của quần thể vi sinh vật trong quá

trình này vẫn chưa được hiểu hết. Bởi vì những kỹ thuật nuôi cấy thông thường đã

được thực hiện là quá chọn lọc cung cấp một bức tranh toàn diện và đáng tin cậy

của toàn bộ mạng lưới vi khuẩn , phân tích tập hợp các phân tử rRNA đã

tìm thấy nhiều ứng dụng rộng rãi cho kỹ thuật phân tích của một số môi trường:

bình phản ứng sinh học hay nhà máy xử lý chất thải. Các chuỗi trình tự được tạo ra

bằng những kỹ thuật phân tích phân tử như kỹ thuật PCR đã được sử dụng tạo ra

các đầu dò oligonucleotide mới cho FISH để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn,

như trong bùn hoạt tính. Gần đây, vào năm 1999 Bond và cộng sự đã

tiến hành xác định các nhóm vi khuẩn trong bùn với sự tăng cường loại bỏ photpho

sinh học. Một số nhóm nhà nghiên cứu khác thì tập trung vào Actinomycetes có

chứa acid mycolic được cho là có chứa nhiều sợi nhỏ tạo bọt trong nhà máy xử lý

nước thải. Ngoài các cá thể của nhóm khuẩn cổ, đặc biệt là

methanogen (một loại khuẩn cổ kị khí có khả năng tạo khí methal), đã được tìm

thấy bằng phương pháp FISH trong quá trình phân hủy kị khí và trong hạt bùn nhỏ,

mặc dù khả năng tự phát huỳnh quang của chúng rất mạnh. Gần đây, sự

kết hợp giữa FISH và bộ vi cảm biến cho phép phân tích đồng thời quần thể vi

khuẩn và các hoạt động trao đổi chất, qua đó phát hiện ra các vi khuẩn kị khí nằm

trong các khe nhỏ thiếu oxy trong môi trường hiếu khí.

2. Vi khuẩn cộng sinh

Hầu hết các vi sinh vật cộng sinh bắt buộc đều chưa tiến hành nuôi cấy được.

Sử dụng rRNA 16S, chúng có thể được định danh và phân cấp phát sinh loài. Việc

khoanh vùng vi sinh vật trong những bộ phận khác nhau của vật chủ bằng FISH có

thể chứng minh được tính chất cộng sinh của chúng, như Amann và cộng sự (1991)

đã làm, người đã xác định được vi khuẩn nội cộng sinh chưa nuôi cấy thuộc chi

Holosporatrên lông của Paramecium caudatum. Từ khi loài Holospora được tìm

thấy trong nhân của các vi sinh vật có lông mịn, nó có thể được nhận biết rõ ràng

vi khuẩn tiêu hóa hiện diện trong các túi thức ăn. Tương tự, FISH cũng được sử

dụng để chứng minh Paramecium caudatum cũng chứa Caedibacter caryophila,

một “kẻ” tiêu diệt vi sinh vật nội cộng sinh mà sự phát triển có liên quan đến loài

Rickettsia. Gần đây, những vi khuẩn nội cộng sinh mới cũng liên quan đến

Rickettsia, điều này đã được chứng minh trên các loài Acanthamoeba[44]. Có một

điều thú vị là các giống amip tương ứng đều đã được phân lập từ các lớp mô mỏng

giác mạc người. Sarcobium lyticum, một loại vi khuẩn có liên quan mật thiết đến

chi Legionella, cũng đã được chứng minh có trong amip được lấy từ mẫu nước bọt

của bệnh nhân viêm phổi. Những chứng minh này cho thấy rằng amip không

những được xem là nguồn gây bệnh cho con người mà còn là vật truyền cho nhiều

loại vi khuẩn cộng sinh khác nhau. Đây có thể là những trường hợp các vi khuẩn

nội cộng sinh không bắt buộc như Legionella pneumophila đã được tìm thấy trong

tế bào Acanthamoeba castellani và trong Tetrahymena pyriformiscó lông

Trong các môi trường nước nghèo dinh dưỡng, Legionellae có thể sống sót

nhưng ở trạng thái vô hoạt, trong đó chúng không bị phát hiện bằng các kỹ thuật

nuôi cấy thông thường. Phục hồi những tế bào vô hoạt trở lại trạng thái hoạt động

đã được điều khiển thành công bằng FISH trong tế bào chủ Acanthamoeba

castellanii. Những nghiên cứu này có một tác động to lớn đối với ngành dịch

tễ học của những mầm bệnh này.

Sử dụng các cách thức lai tại chỗ (ISH) khác nhau, vi khuẩn nội cộng sinh đã

được tìm thấy trong mang của động vật thân mềm hai vỏ Solemya reidii.. Sinh vật

này đã xử lý như một khuôn mẫu để đánh giá kỹ thuật cố định metacrylate và tách

acetone nhằm tăng cường độ tín hiệu và nâng cao độ nhạy của ISH trên các đoạn

mô. Gần đây, Methanobrevibacter– một loài có liên quan với vi khuẩn cổ–

đã được tìm thấy bằng FISH trong một lượng nội bào của Reticulitermes speratus,

một loài mối cánh được thu thập từ các quần đảo Nhật bản .

3. FISH trong y học

3.1. Các quần thể vi khuẩn phức tạp

a. Khoang miệng

Phân tích các quần thể bằng FISH đã thể hiện sự đặc biệt hữu ích trong việc mô

tả các hỗn hợp vi khuẩn phổ biến hay các hệ vi sinh vật nhiễm tạp. Những phân

tích này cho thấy trong khoang miệng người có chứa hơn 300 loài vi khuẩn khác

nhau, trong đó có nhiều loài rất phức tạp khi tiến hành nuôi cấy hoặc chưa từng

được nuôi cấy. Các bệnh về răng miệng như viêm răng hay viêm lợi có liên quan

đến các mạng lưới vi khuẩn đặc thù này. Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy chuyên biệt

sẽ chỉ có được sự xem thường đối với đa dạng vi sinh vật. Những lợi ích khi sử

dụng kỹ thuật FISH đã được thể hiện trên những vi khuẩn kị khí gram âm, như

Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythusvà Prevotella intermediatrong

thành phần mảng bám răng của bệnh nhân viêm răng. Phân tích sâu hơn

trên môi trường phân tử cho thấy một sự đa dạng không ngờ của các loại xoắn

khuẩn trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển nhanh chóng

của viêm răng. Số lượng lớn các vi khuẩn hình xoắn và sự đa dạng hình thái

của chúng.

Hình 6. Nhuộm huỳnh quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng. (a) lai

với các đầu dò vi khuẩn là EUB338 gắn nhãn FITC (xanh lá cây) để hiển thị hình

thái khác nhau của vi khuẩn ở cấp độ đơn bào và TRE I gắn nhãn Cy3 (vàng) để dò

tìm các loài phát sinh thuộc xoắn khuẩn nhóm I, hầu hết chưa được nuôi cấy. (b)

trên cùng một đối tượng, tiến hành lai với đầu dò TRE I gắn nhãn FITC (xanh lá

cây) và TRE II gắn nhãn Cy3 (vàng) dò tìm xoắn khuẩn trong khoang miệng thuộc

các loài phát sinh nhóm II . Cần lưu ý rằng sự phân loại xoắn khuẩn theo các nhóm

phát sinh loài dựa trên những dữ liệu của rRNA 16S .

Hình 7.

FISH quan sát trên một màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 và TRE I. (a) độ

phân giải thấp với chất mang FluoX Cy3.

(b) độ phóng đại cao hơn, các xoắn khuẩn nhóm I (màu vàng), bao quanh là các vi

khuẩn khác (màu xanh lá cây), các tế bào máu (đen) được nhóm lại xung quanh

một lõi dày đặc các vi khuẩn ở trung tâm.

b. Dạ dày – ruột

Vì ruột là phần vi sinh vật phát triển nhiều nhất trong cơ thể con người, sự khỏe

mạnh của hệ ruột và sự hình thành các hệ sinh vật bám dính trên thành ruột người

là điều cần quan tâm nhất. Một lần nữa, các kỹ thuật nuôi cấy thông thường lại

không đánh giá chính xác được số lượng vi khuẩn . Hiện nay, phương pháp

FISH khi nghiên cứu các hệ vi sinh vật đường ruột ở người thường chỉ nghiên cứu

hạn chế ở nguồn phân mà thôi. Số lượng Bifidobacteriumvà vi khuẩn gây hư hỏng

thực phẩm Ramulus flavonoidtrong các mẫu phân được ước tính bằng cách sử

dụng các đầu dò đặc hiệu tương ứng với các chủng, loài vi sinh vật . Sự

biến thiên số lượng vi khuẩn, bao gồm các chủng Bacteroides và Clostridium ssp.,

Streptococcus, Lactococcusvà nhóm Clostridium coccoides-Eubacterium rectale

trong phân người được theo dõi trong khoảng thời gian 8 tháng . Kỹ thuật này

đã được cải tiến tốt hơn bằng cách phát triển khả năng thu nhận hình ảnh tự động

và các phần mềm phân tích cho phép đếm bằng kính hiển vi các nhóm vi khuẩn

đường ruột một cách nhanh và chính xác. Gần đây, sự khác biệt về phát triển

của vi khuẩn đường ruột của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và sữa bột đã được nghiên cứu

. Tuy nhiên, sự phân bố không gian sinh lý của hệ vi khuẩn đường ruột người

và màng sinh học đường ruột vẫn chưa được hiểu rõ hết.

Hiện nay, một số phương pháp đã được áp dụng thành công trên động vật để

nghiên cứu sự phân bố không gian của vi khuẩn đường ruột và để phát hiện toàn bộ

mầm bệnh trong môi trường phức tạp này. E.coli đã được phát hiện trong phần

đông lạnh của ruột lớn chuột bằng cách sử dụng các đầu dò ứng với các vùng đặc

hiệu của 23S rRNA. Trong nghiên cứu này, các tế bào E.coli được quan sát trong

chất nhờn nằm trên các tế bào biểu bì mà không hề có sự gắn kết trực tiếp nào đến

các tế bào này . Các xoắn khuẩn của loài Brachyspira/Serpulina đã được hiển

thị chính xác trong ruột lợn mắc bệnh lỵ (Boye et al., 1998). Brachyspira pilosicoly