Kết quả nhân bản và xác định trình tự đoạn Epitope của gen mã hóa kháng nguyên Cyfra21-1
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015
KẾT QUẢ NHÂN BẢN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN
EPITOPE CỦA GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1
Lê Đình Chắc1
TÓM TẮT
Ung thư phổi là một trong nhữ ng căn bệnh hiểm nghèo do sự tăng sinh không
bình thường của tế bào, thường gặp ở nam giới, chủ yếu là lứa tuổi 50-70. Nghiên cứu
nguồn gốc và sự phát triển của tế bào ung thư phổi dạng không phải tế bào nhỏ, người
ta nhận thấy ung thư có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện hàm lượng kháng nguyên
đặc trưng CYFRA21-1 trong máu, nước mô, huyết thanh. Do vậy việc tìm và xác định
được trình tự gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 là cần thiết, làm cơ sở cho việc
biểu hiện, thu protein CYFRA21-1 tái tổ hợp để phục vụ cho việc tạo KIT chẩn đoán
sớm ung thư phổi dạng không phải tế bào nhỏ đem lại cơ hội sống cho bệnh nhân.
Trong nghiên cứu này, trình tự nucleotide, trình tự amino acicid đoạn epitope
của gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 đã được nhân bản và xác định trình tự với
sự tương đồng là 100% vớ i trình tự amino acid trên Ngân hà ng dữ liệu quố c tế mang
mã số K1C19- HUMAN-P08727.
Từ khóa: Ung thư phổi, gen mã hóa, CYFRA21-1,K1C19- HUMAN-P08727.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thƣ phổi (UTP) là một trong nhƣ̃ ng căn bệnh hiểm nghèo do sƣ̣ tăng sinh
không bình thƣờ ng củ a tế bào , thƣờng gặp ở nam giới , chủ yếu là lứa tuổi 50-70, đặc
biệt liên quan đến những ngƣời đã hoặc đang hút thuố c lá. Đồng thời, UTP cũng là căn
bệnh có tỉ lệ tử vong lớn thƣờng gặp ở ngƣời . Vì vậy, việc phát hiện sớm UTP có ý
nghĩa sống còn với bệnh nhân.
Thực tế, trong y học đã có rất nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để chẩn đoán
UTP (sinh thiết phổi, nội soi phổi, thử đờm, chọc nƣớc màng phổi, chụp quang tuyến
cắt lớp …) và một số phƣơng pháp điều trị UTP (hóa trị liệu, phẫu thuật, xạ trị …) [1].
Tuy nhiên, khi phát hiện UTP thì thƣờng đã muộn hoặc quá muộn, vì một số căn bệnh
khác (viêm phế quản, viêm phổi, lao, …) cũng có những triệu chứng tƣơng tự UTP.
Nghiên cứu tế bào ung thƣ cũng nhƣ nguồn gốc và sự phát triển của tế bào ung
thƣ, ngƣời ta nhận thấy ung thƣ có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện hàm lƣợng các
kháng nguyên đặc trƣng ung thƣ trong máu, nƣớc mô, huyết thanh [2], [5], [6]. Điều
này đã mở ra hƣớng nghiên cứu mới trong chẩn đoán và điều trị ung thƣ trên thế giới
và trong nƣớc.
1 TS. Giảng viên khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Hồng Đức
77
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015
Hiện nay, nhiều chỉ thị kháng nguyên ung thƣ đƣợc biết đến và có thể sƣ̉ dụ ng để
phát hiện ung thƣ nhƣ : CEA, NES, CA125, CYFRA21-1, HER-2/neu … [10], [12],
[13], [14], [15] trong đó, kháng nguyên CYFRA21-1 là một chỉ thị điển hình cho bệnh
UTP dạng không phải tế bào nhỏ (non small cell lung carcinoma - NSCLC) do sự tăng
hàm lƣợng CYFRA21-1 nhanh chóng trong dịch cơ thể khi tế bào biểu mô phổi tăng
sinh bất thƣờng [2], [3], [7], [8], [11]. Vì vậy, phát hiện sớm đƣợc sự tăng hàm lƣợng
CYFRA21-1 trong máu sẽ góp phần chẩn đoán sớm đƣợc UTP và kháng nguyên
CYFRA21-1 có thể đƣợc sử dụng nhƣ là một chỉ thị đặc hiệu để chẩn đoán sớm, từ đó
định hƣớng điều trị hiệu quả UTP dạng NSCLC.
Việc nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp CYFRA21-1 trong UTP là một
trong những hƣớng nghiên cứu mới nhằm xây dựng bộ KIT chẩn đoán, theo dõi và
định hƣớng điều trị kịp thời bệnh UTP dạng NSCLC, góp phần vào những thành tựu
đáng kể trong y học và sinh học.
Trong bài viết này, chúng tôi trình bày kết quả của việc nhân bản và tách dòng
đoạn epitop của gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 làm tiền đề cho các nghiên
cứu tiếp theo.
2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 (Phòng thí nghiệm trọng điểm công
nghệ gen tế bào Động vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) cung cấp.
- Cặp mồi sử dụng để biểu hiện đoạn gen mã hóa epitope kháng nguyên
CYFRA21-1
ExpcyF: 5‟ -CATATGGGCAGGTC-3‟
ExpcyR: 5‟-CTCGAGGTCCATGAGCCGCTGGTAC-3‟
- Vector tách dòng PCR2.1-TOPO do hãng Invitrogen cung cấp. Cặp mồi
M13F/M13R để xác định đoạn gen CYFRA21-1 có trong E. coli có trình tự nhƣ sau:
M13F: 5‟-GTAAAACGACGGCCAG-3‟
M13R: 5‟-CAGGAAACAGCTATGAC-3‟
- Dòng tế bào E. coli DH5α do Trung tâm Công nghệ Protein của Vƣơng Quốc
Anh (MRC-Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) cung cấp. Cặp mồi
LabF/R dùng để nhân bản, khuếch đại thƣ viện thực khuẩn sau mỗi vòng sàng lọc, trình
tự cụ thể nhƣ sau:
LabF: 5‟-CAGGAACAGCTATGAC- 3‟
LabR: 5‟-GAATTTTCTGTATGAGG- 3‟
- Helper phage M13K07 (Invitrogen, CA, USA).
- Bộ KIT tách dòng “TA-Topo Cloning KIT; KIT tách plasmid từ vi khuẩn của
hãng QIAgen; KIT real time-PCR của Roche; KIT tinh sạch thu đoạn DNA từ gel
agarose của hãng Bioscience; KIT Big Dye Terminator sequencing …”.
78
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015
- Các enzym: Taq DNA polymease, Nde I, EcoR I, Xho I, T4 DNA, ligase, … Các
sinh phẩm này do hãng BioLabs cung cấp.
3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thực hiện thành công việc nhân bản và tách dòng đoạn epitop của gen mã hóa
kháng nguyên CYFRA21-1, chúng tôi sử dụng một số các phƣơng pháp sau:
3.1. Phƣơng pháp nhân bản gen bằng PCR
Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng
Dung dịch đệm
Mồi xuôi
Nồng độ
10X
Thể tích(µl)
2,5
1
10 pmol/µl
10 pmol/µl
10-100 ng/µl
5 unit/µl
10nM
Mồi ngƣợc
1
DNA khuôn
Taq-polymerase
dNTPs
1
0,5
2,5
2,5
4
MgCl2
25mM
BSA 1X
1mg/ml
Bổ sung H2O
10
Chạy máy PCR với chu trình nhiệt sau: Biến tính DNA ở 94oC: 2 phút,
thực hiện 30 chu kỳ phản ứng với chu trình nhiệt: 94oC - 45 giây, Tm 55oC - 45
giây, 72oC - 1 phút; kéo dài ở 72oC - 8 phút để hoàn tất phản ứng; sau đó mẫu
đƣợc giữ ở 4oC.
3.2. Phƣơng pháp điện di
Trong điện trƣờng theo chiều từ cực âm đến cực dƣơng, các DNA có kích thƣớc
lớn hoặc mạch thẳng sẽ chuyển động chậm hơn các DNA dạng siêu xoắn hoặc kích
thƣớc bé. Trong một phạm vi nhất định của nồng độ gel agarose, kích thƣớc phân tử tỉ lệ
nghịch với quãng đƣờng dịch chuyển của DNA trên gel agarose. DNA trên gel agarose
đƣợc phát hiện bằng cách nhuộm với Ethidium Bromide (EtBr) và quan sát dƣới tia UV.
3.3. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide
Đây là phƣơng pháp sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) có đánh dấu huỳnh
quang để làm ngừng các mạch đơn DNA đang đƣợc tổng hợp một cách ngẫu nhiên.
Enzym DNA - polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng
hợp ở vị trí 3‟- OH, khi gặp ddNTP (không có nhóm 3‟- OH) thì phản ứng tổng hợp bị
ngừng lại.
79
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015
Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn DNA dài, ngắn khác nhau 1 nucleotide,
có thể phân tách nhờ điện di trên gel agarose, phát hiện các ddNTP đã đánh dấu nhờ
tia laze.
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Nhân bản vùng mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1
Khi nghiên cứu CYFRA21-1 với vai trò là kháng nguyên đặc hiệu UTP dạng
NSCLC, epitope của kháng nguyên này đƣợc quan tâm chủ yếu.
Từ kết quả nghiên cứu sử dụng các phân tử kháng thể để nhận ra vùng epitope
kháng nguyên của Cytokeratin, ngƣời ta nhận thấy, vùng epitope kháng nguyên
CYFRA21-1 nằm trong khoảng amino acid từ 311 đến 368 trên phân tử Cytokeratin 19.
Kết quả này cũng đã đƣợc khẳng định trong một nghiên cứu sử dụng hai kháng thể đơn
dòng: Ks 19.1 (kháng thể nhận biết các amino acid từ vị trí 311 đến 335 trên
Cytokeratin 19) và BM19-21 (kháng thể nhận biết các amino acid từ vị trí 346 đến 367)
[9]. Từ các kết quả của các nghiên cứu trên và dựa vào trình tự nucleotide đoạn gen mã
hóa CYFRA21-1 thu đƣợc cũng nhƣ vị trí vùng epitope kháng nguyên đã đƣợc xác
định, cặp mồi để nhân bản đoạn gen chứa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 làm
cơ sở cho việc biểu hiện protein CYFRA21-1 đã đƣợc thiết kế.
Để tạo điều kiện thuận lợi trong việc tạo vector tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa
epitope kháng nguyên CYFRA21-1 biểu hiện protein CYFRA21-1 trong E. coli, các
mồi đặc hiệu có chứa trình tự nhận biết của hai enzym cắt hạn chế Nde I và Xho I đã
đƣợc sử dụng dễ dàng hơn trong việc gắn gen Cyfra21-1 vào các vị trí tƣơng ứng của
vector biểu hiện pET-21a(+) nhằm thu protein CYFRA21-1 tái tổ hợp phục cho các
nghiên cứu sau này.
Trong nghiên cứu này, vector biểu hiện pET-21a(+) đƣợc sử dụng để thu protein
CYFRA21-1 tái tổ hợp phục cho các nghiên cứu tiếp theo.
Thành phần của phản ứng nhân bản đoạn gen mã hóa epitope kháng nguyên
CYFRA21-1 gồm:
DNA khuôn (Sản phẩm PCR có trình tự đã đƣợc xác định khoảng 400 bp thu
đƣợc ở trên), dNTPs, mồi ExpcyF và ExpcyR, enzym Taq-DNA polymerase, dung
dịch đệm, dung dịch MgCl2, nƣớc với tỷ lệ thích hợp trong tổng thể tích 25 l. Chu
trình nhiệt: 1 chu kỳ 94oC thời gian 4 phút; 25 chu kỳ (94oC thời gian 30 giây, 54oC thời
gian 30 giây, 72oC thời gian 60 giây); 72oC thời gian 5 phút và lƣu ở 4oC. Sau khi nhân
bản đoạn gen chứa epitope kháng nguyên CYFRA21-1, chúng tôi tiến hành kết quả kiểm
tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 0,8% đã đƣợc kiểm tra (Hình 4.1).
80
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015
M
1
2
300 bp
200 bp
Sản phẩm PCR ≈ 250 bp
Hình 4.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
Làn chạy M: Thang DNA chuẩn 100 bp
Làn chạy số 1 và số 2: Sản phẩm PCR
Kết quả điện di trên gel agarose ở hình 4.1 cho thấy, trên làn chạy số 1 và số 2
có một băng sáng đậm với kích thƣớc khoảng 250 bp. Kích thƣớc này phù hợp với
những tính toán về chiều dài đoạn chứa vùng epitope của gen mã hóa kháng nguyên
CYFRA21-1, chứng tỏ đoạn gen mã hó a cho vù ng epitope kháng nguyên CYFRA 21-1
đã đƣợ c nhân bản thành công vớ i cặp mồ i ExpcyF/R.
Để thuận lợ i cho việc thiết kế vector biểu hiện và lƣu giƣ̃ nguồ n gen , đoạn gen
thu đƣợ c đã đƣợc gắn vào vector tách dò ng.
4.2. Tách dꢀng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1
Nhờ hoạt tính củ aTaq-polymerase, sản phẩm PCR có thêm nucleotide A tự do ở hai
đầu củ a gen. Vector tách dò ng pCR2.1 đƣợ c tạo ra dƣớ i dạng mạch thẳng vớ i hai nculeotide
Thymine tƣ̣ do bổ sung vớ i nucleotide Adenin. Dƣớ i tác dụ ng củ a enzym topoisomerase,
sản phẩm PCR đƣợc gắn vào vector, quy trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn
trực tiếp sản phẩm phản ứng PCR vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen).
Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng đƣợc thực hiện với mục đích
tạo vector tái tổ hợp mang đoạn DNA cần tách dòng. Nguyên tắc của phản ứng này là
dựa trên việc tạo ra một gốc Adenin tự do đầu 3‟ trên sản phẩm của enzym Taq mà
không phụ thuộc vào trình tự khuôn, trong khi đó một gốc Thymine tự do đƣợc thiết kế
trên vector tách dòng pCR2.1. Điều này cho phép sản phẩm PCR có thể gắn vào vector
dễ dàng hơn khi có mặt của enzym xúc tác.
Trong phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng, enzym topoisomerase
(có trong bộ “TA Cloning KIT”), sẽ bám vào DNA tại một vị trí đặc hiệu và cắt bỏ liên
kết phosphodieste ở đầu 5‟-CCCTT trên một chuỗi đơn của vector, đồng thời tạo nên
liên kết cộng hóa trị giữa gốc phosphat đầu 3‟ của chuỗi vừa bị cắt với tyrosine tại vị trí
274 của enzym topoisomerase bằng chính năng lƣợng của liên kết phosphodieste.
81
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015
Tiếp theo, liên kết giữa gốc phosphat của DNA và tyrosine của enzym bị phá vỡ
nhờ tác động của nhóm 5‟-OH của sợi đơn đã bị cắt trƣớc đó, điều này sẽ làm chuyển
hƣớng phản ứng và giải phóng enzym topoisomerase.Với các thao tác nhƣ trên, chúng
tôi thu đƣợc vector tái tổ hợp mang đoạn gen DNA mã hóa epitope kháng nguyên
CYFRA21-1 đã thu đƣợc.
Sau đó, sản phẩm PCR khi đƣợc gắn với vector tách dòng sẽ đƣợc biến nạp vào
vi khuẩn E. coli chủng TOP10, tiếp theo, dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp mang gen
đích bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi M13F/R đã đƣợc chọn.
Các dòng đã chọn đƣợc tách chiết plasmid và điện di kiểm tra trên gel agarose.
Vớ i cách tiến hành nhƣ vậy, dòng vector tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa vùng
epitope kháng nguyên CYFRA21-1 đã đƣợc chọn.
Sau đó, đoạn gen mã hó a vù ng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 đƣợ c xác định
®
trình tự trên máy ABI PRISM 3100-Avant Gentic Analyze,r trình tự nucleotide và trình tự
amino acid củ a đoạn gen thu đƣợ c trong vector tách dò ng p2C.1Rđƣợ c thể hiện trên hình4.2
CATATGGGCAGGTCCGAGGTTACTGACCTGCGGCGCACCCTTCAGGGTCT
TGAGATTGAGCTGCAGTCACAGCTG 75
H M G R S E V T D L R R T L Q G L E I E L Q S Q L
AGCATGAAAGCTGCCTTGGAAGACACACTGGCAGAAACGGAGGCGCGCT
TTGGAGCCCAGCTGGCGCATATCCAG 150
S M K A A L E D T L A E T E A R F G A Q L A H I Q
GCGCTGATCAGCGGTATTGAAGCCCAGCTGGGCGATGTGCGAGCTGATAG
TGAGCGGCAGAATCAGGAGTACCAG 225
A L I S G I E A Q L G D V R A D S E R Q N Q E Y Q
CGGCTCATGGACCTCGAGTGA
R L M D L E *
246
Hình 4.2. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn gen mã hóa vùng epitope
kháng nguyên CYFRA21-1
Kết quả phân tích trình tự amino acid cho thấy , đoạn gen đã gắn vào vector tách
dòng đúng theo tính toán và có độ tƣơng đồ ng là100% vớ i trình tƣ̣ amino acid trên Ngân
hàng dữ liệu quốc tế mang mã số K 1C19- HUMAN-P08727. Kết quả này có đủ độ tin
cậy để biểu hiện và thu protein CYFRA21-1 phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
5. KẾT LUẬN
Đoạn epitope của gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 với cặp mồi đặc hiệu
đã đƣợc nhân bản thành công.
Đoạn epitope của gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 đã đƣợc tách dòng và
xác định trình tự. Trình tự amino acid đoạn epitope của gen mã hóa kháng nguyên
CYFRA21-1 thu đƣợc có độ tƣơng đồ ng là 100% vớ i trình tƣ̣ amino acid đ oạn epitope
82
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015
của gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1đã đƣợc công bố trên Ngân hàng dữ liệu
quố c tế mang mã số K1C19- HUMAN-P08727.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[2]
prognostic value of both neuron-specific enolase (NSE) and CYFRA21-1 in
Med, 98(4), pp. 357-362.
[3]
[4]
[5]
Bộ môn ung thƣ - Đại học Y Hà Nội (1999), Ung thư học, Nxb Y học, Hà Nội.
[6]
[7]
pp. 1011- 1014.
[8]
[9]
83
TẠP CHÍ KHOA HỌC, TRƢỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC - SỐ 24. 2015
“Diagnostic value of Her-2/neu, CYFRA21-1, and carcinoembryonic antigen
levels in malignant pleural effusions of lung adenocarcinoma”, Pathology,
42(3), pp. 224-228.
417-423.
“Tumor markers (CEA, CA 125, CYFRA21-1, SCC and NSE) in patients with
non-small cell lung cancer as an aid in histological diagnosis and prognosis.
Comparison with the main clinical and pathological prognostic factors”,
Tumour Biol, 24(4), pp. 209-218.
“Performance characteristics of an automated assay for the quantitation of
RESULTS OF EPITOPE SEGMENT REPLICATION AND
SEQUENCE DETERMINATION OF ANTIGEN GENES
CYFRA21-1
Le Dinh Chac
ABSTRACT
Lung cancer is one of the serious diseases caused by the abnormal proliferation
of cells, commonly found in men aged 50-70 . When studying the origin and
development of lung cancer non-small cells, researchers have found that cancer is
closely associated with the antigen concentration characterized CYFRA21-1 in the
blood, tissue water and serum. Therefore, it is necessary that the gene encoding the
antigen CYFRA21-1 be found and sequenced to serve as the basis for the obtainment of
CYFRA21-1 recombinant protein which helps create KIT used for an early diagnosis of
pulmonary cancer of non-small cell form. This would in turn help save life for patients.
In this study, sequenced nucleotides and amino acicid of epitope segments of
genes encoding antigens CYFRA21-1 and 100% these nucleotides and amino acicid
are 100% to similar the amino acid sequence in the International Data Bank coded
K1C19- HUMAN-P08727.
Key words: Lung cancer, gene encoding, CYFRA21-1, K1C19- HUMAN-P08727.
84
8 trang
15/01/2024
10540
Free
Bạn đang xem tài liệu "Kết quả nhân bản và xác định trình tự đoạn Epitope của gen mã hóa kháng nguyên Cyfra21-1", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- ket_qua_nhan_ban_va_xac_dinh_trinh_tu_doan_epitope_cua_gen_m.pdf
