Biểu hiện dung hợp gen mã hóa kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp nhận biết kháng nguyên nhóm máu với Thioredoxin trong tế bào Escherichia Coli
TAP CHI SINH HOC 2019, 41(1): 45–52
DOI: 10.15625/0866-7160/v41n1.10924
EXPRESSION OF THE RECOMBINANT SINGLE CHAIN VARIABLE
FRAGMENTS RECOGNIZING BLOOD ANTIGEN FUSED WITH
THIOREDOXIN IN Escherichia coli
Dang Thi Ngoc Ha, Le Thi Thu Hong*, Truong Nam Hai*
1Institute of Biotechnology, VAST, Vietnam
2Graduate University of Science and Technology, VAST, Vietnam
Received 1 December 2017, accepted 2 February 2019
ABSTRACT
The technology of recombinant single chain variable fragments (scFvs) expression has been used
in research, diagnosis and treatment of diseases. In the previous study, we studied the expression
of a recombinant single chain variable fragment recognizing blood A antigen (antiA-scFv) in E.
coli. However, the protein was insoluble form resulting in difficulty for purification, refolding
and activity assesment. Here, we present the study on fused expression of the recombinant scFv -
specific blood A antigen with thioredoxin (Trx) in the expression vector pET32a(+). The results
showed that the Trx/antiA-scFv fusion protein was expressed with molecular weight of 49 kDa in
a soluble form reaching 40% of the total recombinant protein. This result facilitates the optimal
condition of soluble protein expression, purification and bioactivity determination of the antiA-
scFv recombinant antibody.
Keywords: Escherichia coli, blood group A, single recombinant proteins, fusion expression,
soluble protein, thioredoxin.
Citation: Dang Thi Ngoc Ha, Le Thi Thu Hong, Truong Nam Hai, 2019. Expression of the recombinant single chain
variable fragments recognizing blood antigen fused with thioredoxin in Escherichia coli. Tap chi Sinh hoc, 41(1): 45–
©2019 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST)
45
TAP CHI SINH HOC 2019, 41(1): 45–52
DOI: 10.15625/0866-7160/v41n1.10924
BIỂU HIỆN DUNG HỢP GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ ĐƠN CHUỖI
TÁI TỔ HỢP NHẬN BIẾT KHÁNG NGUYÊN NHÓM MÁU
VỚI THIOREDOXIN TRONG TẾ BÀO Escherichia coli
Đặng Thị Ngọc Hà, Lê Thị Thu Hồng*, Trƣơng Nam Hải*
1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Ngày nhận bài 1-12-2017, ngày chấp nhận 2-2-2019
TÓM TẮT
Công nghệ biểu hiện kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp (scFv) đã được ứng dụng trong nghiên cứu,
chẩn đoán và điều trị bệnh. Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã nghiên cứu biểu hiện kháng thể
đơn chuỗi nhận biết kháng nguyên nhóm máu A (antiA-scFv) trong tế bào Escherichia coli. Tuy
nhiên, phân tử kháng thể đơn chuỗi dạng đơn được biểu hiện không tan gây khó khăn cho quá
trình tinh sạch, tái cấu trúc và đánh giá hoạt tính. Trong nghiên cứu này, chúng tôi công bố kết
quả nghiên cứu biểu hiện kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp nhận biết kháng nguyên nhóm máu ở
dạng tan khi dung hợp với thioredoxin trong vector biểu hiện pET32a(+). Protein dung hợp
Trx/antiA-scFv đã được tổng hợp trong tế bào E. coli với kích thước phân tử 49 kDa và chiếm
khoảng 40% ở dạng tan. Kết quả này tạo thuận lợi cho nghiên cứu tối ưu sự biểu hiện dạng tan,
thuận lợi cho tinh chế và xác định hoạt tính của antiA-scFv tái tổ hợp.
Từ khóa: Escherichia coli, biểu hiện dung hợp, kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp, nhóm máu A,
thioredoxin, protein tan.
MỞ ĐẦU
Sản xuất kháng thể theo công nghệ tế bào
giá c o, điều kiện nuôi cấy và dự trữ tế bào
rất nghiêm ng t.
Nh sự phát triển của công nghệ sản xuất
protein tái tổ hợp, hiện n y các phân đoạn
kháng thể, kháng thể đơn chuỗi (scFv) có thể
được tạo ra trong tế bào E. coli (Ahmad et al.,
2012, Spadiut et al., 2014) ây là một hệ
biểu hiện được nghiên cứu khá kỹ về đ c tính
di truyền, thao tác đơn giản, có khả năng tổng
hợp lượng lớn protein ngoại lai với điều kiện
nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền Ngoài r , trong
quá tr nh sản xuất, scFv cũng có thể được cải
biến di truyền để làm tăng một số tính chất
của phân tử kháng thể như làm tăng tính ái lực
và tính đ c hiệu (Song et al., 2014). Cho đến
nay, kháng thể đơn chuỗi được ứng dụng rất
nhiều trong chẩn đoán (Ahmad et al., 2012).
Bên cạnh đó, kháng thể đơn chuỗi có thể được
lai đã thu được nhiều thành công và đã được
ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu,
chẩn đoán và điều trị bệnh như là các bệnh tự
miễn, nhiễm khuẩn và bệnh ung thư Tuy
nhi n, trong nhiều trư ng hợp, kháng nguy n
tinh khiết không có s n để gây miễn dịch,
đ c biệt là các kháng nguy n bề m t h y là
các protein màng ây là các kháng nguy n
rất dể mất cấu trúc trong quá tr nh tinh sạch
Ngoài r , công nghệ tế bào l i cũng bộc lộ
hạn chế về cơ chế dung hợp tế bào, sự không
bền vững của tế bào l i dùng để sản xuất
kháng thể... Hơn nữa, sản xuất kháng thể đơn
dòng bằng công nghệ tế bào lai có giá thành
c o do môi trư ng nuôi cấy tế bào động vật
46
Biểu hiện dung hợp gen mã hóa kháng thể đơn chuỗi
sử dụng cho mục đích điều chỉnh và phát hiện kháng thể kháng IgG-peroxidase chuột
sự hoạt động của các protein trong tế bào, như (Sigma, Hoa Kỳ).
vậy phù hợp cho việc sử dụng làm vaccine
(Alvarez-Rueda et al., 2009). Ngoài ra, kháng
thể đơn chuỗi còn được ứng dụng trong điều
trị ung thư (Chester et al., 2004) và chống lại
virus bệnh dại glycoprotein (Yuan et al.,
2013).
C c r n mồ c o PC
Mồi xuôi F - NcoI: 5’-TACCATGGC
GCAGGTCCAAGTGCAGC-3’
Mồi ngược R - XhoI: 5’-TGCTCGAGTT
ACAGGTCTTCTTCGC-3’
Tuy nhiên, bên cạnh những thuận lợi, hệ
biểu hiện này cũng bộc lộ những hạn chế
trong nghi n cứu biểu hiện scFv, trong đó
phải kể đến sự h nh thành thể vùi củ phân tử
kháng thể, sự tạo thành protein với hoạt tính
li n kết thấp, cấu trúc không bền và độc cho
tế bào chủ Do đó, mỗi loại scFv cần nghiên
cứu tìm kiếm thiết kế và chủng biểu hiện
thích hợp.
Hóa chất, enzyme
Hóa chất, enzyme sử dụng cho nghiên cứu
APS, TEMED, Chloroform, Ethidium
brobmide, Glucose, Glycerol, Glycine,
Isoamyl-alcohol, Ethanol, Methanol, Peptone,
Yeast Extract, SDS, Tris, Acrylamid, Bis
Acrylamide, Agar, Agarose, Coomassie
(Merck, ức); KIT tinh sạch DNA GFXTM
(code 28-9034-70, GE Healthcare Life
Science, Anh); dNTP, Taq DNA polymerase,
Dnase I, T4 DNA – ligase, các enzyme hạn
chế (Fermentas, Hoa Kỳ); skimmilk của hãng
(Difco, Hoa Kỳ); kháng sinh Ampiciline,
TMB của hãng (Sigma, Hoa Kỳ).
Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã
công bố kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng
thể đơn chuỗi antiA-scFv trong vector biểu
hiện pET22b(+). Protein antiA-scFv tái tổ hợp
đã được tổng hợp trong tế bào E. coli. Tuy
nhiên, antiA-scFv đã tồn tại ở dạng không tan
( ng Thị Ngọc Hà và nnk., 2017). Trong bài
báo này, chúng tôi công bố kết quả biểu gen
dung hợp mã hóa kháng thể đơn chuỗi nhận
biết kháng nguyên nhóm máu A với protein
thioredoxin (Trx/antiA-scFv). Protein dung
hợp đã được biểu hiện ở dạng tan, thuận lợi
cho quá trình tinh sạch và xác định hoạt tính.
PCR khuếc đạ đoạn gen antiA-scFv
Gen antiA-scFv được nhân lên bằng PCR
từ vector pET22b+/antiA-scFv dung dịch với
thành phần: 18 µl dH2O, 2,5 µl đệm 10×2,5 µl
dNTP 2 mM, 0,5 µl mồi xuôi F: NcoI 10 µM,
0,5 µl mồi ngược F: NcoI 10 µM, 0,5 µl
khuôn pET22b+/antiA-scFv, 0,5 µl Taq
polymerase. Chương tr nh PCR: Biến tính
95oC: 3 phút; l p lại 30 chu kỳ với 3 bước:
94oC: 30 giây; 58oC: 30 giây; 72oC: 60 giây;
bước kéo dài 72oC: 10 phút.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
Chủng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn E. coli DH10b
(Invitrogen, Hoa Kỳ) được sử dụng để tách
dòng gen, các chủng E. coli JM109, BL21
(DE3), Rosseta 2 (Invitrogen, Hoa Kỳ) sử
dụng để biểu hiện gen.
Thiết kế vector biểu hiện pET32a+/antiA-
scFv
Gen antiA-scFv s u khi được nhân lên
bằng PCR được cắt bằng 2 enzyme hạn chế
XhoI và NcoI. ồng th i, vector pET32a+
cũng được cắt bằng 2 enzyme này Sản phẩm
gen và vector được tinh sạch bằng KIT thôi
gel củ Qi gen oạn gen antiA-scFv được
ghép nối với vector biểu hiện pET32a+ bằng
enzyme T4 ligase. Sản phẩm của phản ứng
ghép nối được biến nạp vào tế bào E. coli
DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt và trải
tr n môi trư ng đĩ thạch LB có bổ sung
100 µg/ml ampicillin (LBA) (Sambrook &
Plasmid
pET22b+/antiA-scFv được sử dụng để
nhân dòng gen antiA-scFv; Plasmid pET32a+
(Novagen, Hoa Kỳ) là các vector biểu hiện
gen.
Kháng thể
Kháng thể đơn dòng kháng C-myc từ
huyết thanh của chuột (Sigma, Hoa Kỳ);
47
Dang Thi Ngoc Ha et al.
W. Russell, 2001). Các dòng biến nạp được
tách plasmid và kiểm tra sự có m t của gen
antiA-scFv bằng các enzyme hạn chế XhoI,
NcoI và XbaI. Vector biểu hiện gen
pET32/antiA-scFv chọn được được biến nạp
vào các chủng biểu hiện.
SDS-PAGE sẽ được chuyển sang màng
PVDF S u đó, màng được ủ lần lượt với
Skimmilk 5% trong TBS 1x, kháng thể 1
kháng C-myc, kháng thể 2 antimouse IgG-
peroxidase trong 1 gi . Cuối cùng phản ứng
l i được hiện màu bằng dung dịch TMB.
Biểu hiện gen antiA-scFv
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Các chủng E. coli BL21 (DE3), JM109,
Thiết kế vector biểu hiện pET32/antiA-
scFv
Rosetta
mang
vector
biểu
hiện
pET32a(+)/antiA-scFv được nuôi cấy trong
môi trư ng LBAmp, nuôi lắc 200 vòng/phút ở
37oC qu đ m S u đó, dịch tế bào nuôi qua
đ m được chuyển s ng môi trư ng LBA mới
với OD600 khoảng 0,1; nuôi tiếp ở 37oC, lắc
200 vòng/ phút đến khi OD600 đạt 0,3–0,5.
Dịch nuôi cấy được cảm ứng với 0,1 mM
isopropyl β- D- thiogalactopyranoside (IPTG)
(Studier et al., 1990) và chuyển sang nuôi lắc
200 vòng/ phút ở 20oC trong 16 gi . Sau lên
men, tế bào được thu lại bằng ly tâm 5000
vòng/ phút trong 5 phút và được hòa lại về
cùng một mật độ tế bào OD600 =10 trong đệm
20 mM Tris-HCl, pH = 8. Kiểm tra sự biểu
hiện protein tái tổ hợp bằng điện di SDS-
PAGE và Western blot.
Vector pET32a+ ngoài những ưu điểm
của hệ vector pET nó còn chứa trình tự gen
mã hóa cho protein thioredoxin (Trx) ngay
trước vùng đ nối cùng với trình tự mã hó
His-tag, S-t g Khi gen được gắn vào vùng đ
nối của vector, sản phẩm của quá trình dịch
mã sẽ là protein dung hợp trong đó protein tái
tổ hợp được gắn với protein Trx và đoạn His-
tag, S-tag vì vậy, rất thuận thiện cho việc tinh
sạch protein sau này. Ngoài ra, protein Trx có
chức năng trong việc khử các gốc cysteine
được oxy hó , như vậy có thể giúp làm giảm
sự kết tụ của các protein và dẫn đến làm tăng
tính tan của các protein tái tổ hợp (Nakamura
et al., 1997).
Tách chiết protein tái tổ hợp từ tế bào E. coli
a
b
Tế bào E. coli tái tổ hợp sau khi lên men
được thu lại bằng ly tâm 5000 vòng/phút trong
5 phút. Hòa lại tế bào trong đệm Tris HCl 20
mM, pH=8 để đư mẫu về OD = 10. Dịch tế
bào được siêu âm trong 10 phút (3 giây/xung,
nghỉ 3 giây giữa các xung) với cư ng độ 85
Amp. S u si u âm, mẫu được ly tâm 8000
vòng/phút trong 10 phút để phân thành pha
tan và pha tủa. Pha tủ được hòa lại về thể tích
b n đầu trong đệm 20 mM Tris HCl, pH=8.
Các mẫu tan và tủ đều được điện di kiểm tra
trên gel SDS-PAGE 12,6% (Laemmli, 1970).
Hình 1. Kết quả kiểm tr gen antiA-scFv và
vector pET32a+: a. Sản phẩm khuếch đại gen
antiA-scFv; b. Sản phẩm cắt vector pET32a+
và gen antiA-scFv bằng enzyme hạn chế XhoI
+ NcoI ư ng chạy M: thang DNA chuẩn
1kb (Ferment s) ư ng chạy 1: Sản phẩm
tinh sạch gen antiA-scFv ư ng chạy 2, 3:
Lần lượt là sản phẩm cắt vector pET32a+, gen
antiA-scFv bằng enzyme hạn chế XhoI + NcoI
K ểm ra b ểu ện pro e n bằng SDS-
PAGE và Western blot
iện di protein tr n gel SDS-PAGE
(Laemmli, 1970) và thí nghiệm lai Western
blot theo phương pháp đã mô tả ( ng Thị
Ngọc Hà và nnk., 2017) Về cơ bản, protein
Trx/antiA-scFv tái tổ hợp đựợc nhận biết qua
phản ứng lai Western blotting với kháng thể
kháng C-myc Protein s u khi điện di trên gel
ể đư gen antiA-scFv vào vector biểu
hiện pET32 +, chúng tôi đã khuếch đại đoạn
gen này từ plasmid pET22b+/antiA-scFv bằng
c p mồi đ c hiệu F-NcoI và R-XhoI Sản
48
Biểu hiện dung hợp gen mã hóa kháng thể đơn chuỗi
ể có thể kết luận chính xác đã tạo được
phẩm khuếch đại gen antiA-scFv là một băng
duy nhất và sắc nét có kích thước khoảng 882 vector tái tổ hợp pET32 +/ nti -scFv, chúng
bp (hình 1 ) oạn gen antiA-scFv s u đó tôi đã chọn dòng pl smid để cắt kiểm tra bằng
được ghép nối với vector biểu hiện pET32a+. các enzyme hạn chế Xba I, Xho I và Nco I.
ể có thể gắn được gen antiA-scFv vào vector Theo lý thuyết, trên vector pET32a+ có chứa
biểu hiện pET32a+ thì vector pET32a+ và một điểm cắt của enzyme Xba I, trong trình tự
đoạn gen antiA-scFv đều được xử lý bằng gen antiA-scFv không chứ điểm cắt của
enzyme hạn chế Xho I và Nco I. Sau khi xử lý enzyme này nên khi cắt pET32a+/antiA-scFv
bằng enzyme hạn chế, chúng tôi đã tinh sạch bằng Xba I vector này sẽ được cắt mở vòng
đoạn gen và vector bằng KIT tinh sạch Qiagen Ngoài r , tr n vector pET32 + có chứ 1 điểm
(hình 1b) Kết quả kiểm tr sản phẩm cho cắt của Xho I và 1 điểm cắt của Nco I ngay tại
thấy, sau khi tinh sạch đoạn gen và vector đã vị trí chèn gen antiA-scFv nên khi cắt bằng cả
thu được một băng duy nhất và có thể dùng để hai enzyme này sẽ tạo r đoạn gen có kích
ghép nối với nhau.
thước khoảng 884 nucleotide. Kết quả điện di
trên hình 2b cho thấy, khi cắt pl smid tái tổ
hợp bằng enzyme Xho I + Nco I, tr n đư ng
chạy 5 xuất hiện 2 băng DN trong đó có 1
băng có kích thước khoảng 884 bp. Trên
đư ng chạy 6 chỉ xuất hiện 1 băng duy nhất
có kích thước khoảng gần 7.000 bp, chứng tỏ
plasmid chỉ được cắt mở vòng. Với kết quả
kiểm tra trên, chúng tôi có thể khẳng định gen
antiA-scFv đã được ch n vào vector pET32 +
(được đ t t n là pET32 +/ nti -scFv).
a
b
Biểu hiện protein dung hợp Trx/antiA-scFv
Hình 2. Kiểm tr kết quả tạo pl smid tái tổ
hợp pET32 +/ nti -scFv: a. Kết quả tách
dòng plasmid sản phẩm lai pET32a+ và gen
antiA-scFv; b. Sản phẩm cắt kiểm tra plasmid
bằng các enzyme hạn chế XhoI + NcoI và
XbaI ư ng chạy (-): pET32a+ không mang
gen ư ng chạy 1, 2, 3, 4: lần lượt là plasmid
tách từ các dòng khuẩn lạc khác nh u ư ng
chạy M: Thang DNA chuẩn 1 Kb. ư ng
chạy 5, 6: lần lượt là sản phẩm cắt
Sau khi thiết kế được vector biểu hiện
mang gen antiA-scFv chúng tôi đã biến nạp
plasmid tái tổ hợp vào các chủng biểu hiện E.
coli BL21 (DE3), JM109, Rossetta 2. Gen
antiA-scFv trong các plasmid tái tổ hợp hoạt
động dưới sự điều khiển của promoter T7.
Promoter này được kiểm soát ch t chẽ bởi
chất cảm ứng IPTG (Studier, 2005). Theo lý
thuyết, protein Trx/antiA-scFv (dạng dung
hợp với Trx khi biểu hiện trong pET32a+) có
kích thước khoảng 49 kDa. Với điều kiện môi
trư ng LBA, cảm ứng 0,1 mM IPTG khi
OD600 đạt khoảng 0,4, s u đó nuôi cảm ứng ở
20oC, thu mẫu sau 16 gi nuôi cấy, kết quả
biểu hiện Trx/antiA-scFv trong chủng JM109
được thể hiện trên hình 3a cho thấy protein
biểu hiện tổng số của dòng tái tổ hợp xuất
hiện một băng protein đậm nét có kích thước
đúng như dự đoán Trong khi các đư ng chạy
đối chứng âm là mẫu biểu hiện protein tổng số
chứa vector không mang gen không xuất hiện
các băng đậm nét có kích thước như vậy. Bên
cạnh đó, chúng tôi cũng đã kiểm tra biểu hiện
của antiA-scFv trong chủng BL21(DE3) và
pET32a+/antiA-scFv bằng enzyme XhoI +
NcoI và enzyme XbaI
oạn gen antiA-scFv được ghép nối vào
vector pET32a+. Kết quả biến nạp sản phẩm
lai cho thấy tr n đĩ LB xuất hiện nhiều
khuẩn lạc màu trắng đục, tròn và bóng. Lựa
chọn một số dòng khuẩn lạc để tách plasmid,
điện di kiểm tra (hình 2a). Kết quả cho thấy
tất cả các mẫu pl smid tách từ các dòng 1, 2,
3, 4 đều c o hơn dòng đối chứng là pET32a+
không m ng gen Như vậy, có khả năng đoạn
gen antiA-scFv đã được chèn vào vector
pET32a+.
49
Dang Thi Ngoc Ha et al.
Rosett 2 trong cùng điều kiện như JM109 cũng nhận thấy quá trình biểu hiện dung hợp
Kết quả biểu hiện Trx/antiA-scFv trong chủng củ protein ngoại lai với các yếu tố Trx,
BL21 (DE3) cho thấy protein Trx/antiA-scFv SUMO trong E. coli giúp cải thiện đáng kể
biểu hiện rất kém. Trong chủng Rosseta 2, năng xuất protein Nhận định này cũng tương
Trx/antiA-scFv biểu hiện tương đối tốt (kết đồng với kết quả nghi n cứu biểu hiện kháng
quả không được tr nh bày) Như vậy, chủng thể đơn chuỗi nhận biết VEGF 165 dung hợp
biểu hiện đóng v i trò qu n trọng trong việc với SUMO (Ye et al., 2008) và nghiên cứu
tăng năng suất protein tái tổ hợp mong muốn biểu hiện kháng thể đơn chuỗi dung hợp với
Kết quả này cũng phù hợp với kết luận của thioredoxin trong tế bào chất của E. coli
Joseph et al. (2015) ồng th i, chúng tôi (Jurado et al., 2006).
a
b
c
kDa
116
M (-) TS
M TS (-)
66
45
35
25
18
14
Hình 3. Kiểm tra sự biểu hiện protein Trx/antiA-scFv trong chủng E. coli: a. SDS-PAGE,
b. Western blot với c-myc, c. Kiểm tra mẫu protein ở pha tan và không tan;
ư ng chạy M: Thang protein chuẩn (Fermentas); (-): ối chứng âm,
vector không mang gen; TS: Mẫu tổng số; S: Pha tan; P: Pha tủa
ể khẳng định chắc chắn protein trên là ứng của protein dạng dung hợp Trx/antiA-
protein tái tổ hợp mong muốn, ngoài việc xác scFv Tr n đư ng chạy mẫu đối chứng âm
định protein biểu hiện qu băng điện di trên không mang gen antiA-scFv không thấy băng
gel SDS-P GE chúng tôi đã tiến hành kiểm nào xuất hiện Như vậy, chúng tôi đã thiết kế
tra bằng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot. và biểu hiện thành công protein antiA-scFv
Dựa trên thiết kế gen antiA-scFv có chứa một dạng dung hợp cùng Trx trong vector
vùng trình tự mã hó C-myc để hỗ trợ xác pET32a+.
định sự biểu hiện protein tái tổ hợp Các mẫu
Các protein chỉ thể hiện được hoạt tính khi
biểu hiện protein tái tổ hợp dạng dung hợp
tồn tại ở dạng tan. Tuy nhiên, hầu như protein
Trx/antiA-scFv được lai với kháng thể C-myc
có nguồn gốc từ tế bào nhân chuẩn được tổng
sản xuất từ chuột và kháng thể hai là kháng
hợp bởi hệ biểu hiện E. coli thư ng tồn tại ở
thể kháng IgG-peroxidase của chuột Như
dạng không tan. Trong nghiên cứu trước,
vậy, chỉ có protein nào có C-myc mới có thể
chúng tôi đã kiểm tra tính tan của protein
bắt đ c hiệu với kháng thể C-myc và xuất hiện
antiA-scFv biểu hiện dạng đơn trong các
trên màng lai.
chủng Rosetta2 và JM109. Kết quả kiểm tra
Kết quả Western blot trên hình 3b cho cho thấy, Trx/antiA-scFv biểu hiện dạng đơn
thấy, tr n đư ng chạy protein từ chủng tái tổ trong chủng Rosetta2 hoàn toàn ở trạng thái
hợp có xuất hiện băng protein có kích thước không tan ( ng Thị Ngọc Hà và nnk., 2017).
khoảng 49 kD ó chính là vị trí băng tương Có thể do sự biểu hiện quá mức của protein
50
Biểu hiện dung hợp gen mã hóa kháng thể đơn chuỗi
TÀI LIỆU THAM KHẢO
trong chủng này dẫn đến sự hình thành không
đúng các cầu nối disulfide của protein tái tổ
hợp (Joseph et al., 2015). Ở đây, dựa vào mức
độ đậm củ băng protein được quan sát trên
SDS-PAGE của các mẫu sau khi phân tách
pha tan và pha tủa cho thấy protein dung hợp
Trx/antiA-scFv tái tổ hợp dạng tan chiếm tỷ lệ
khoảng 40 tổng số Trx/antiA-scFv được tạo
ra (hình 3c). Kết quả này là cơ sở cho nghiên
cứu tối ưu biểu hiện protein ở dạng tan.
Ahmad Z. A., Yeap S. K., Ali A. M., Ho W. Y.,
Alitheen N. B. M, Hamid M., 2012. ScFv
antibody: Principles and clinical application.
Clin. Dev. Immunol., 2012: 1–15.
Alvarez-Rueda N., Ladjemi M. Z., Behar G.,
Corgnac S., Pugniere M., Roquet
single domain anti-idiotypic antibody
Theo các nghiên cứu, sự hạn chế trong quá
trình biểu hiện kháng thể tái tổ hợp trong E.
coli là do trong cấu trúc phân tử kháng thể có
các cầu nối disulfide. Sự hình thành không
đúng cấu trúc disunfide sẽ dẫn đến sự biểu
hiện protein ở dạng thể vùi và làm mất đi hoạt
tính sinh học củ protein Trong khi đó, mỗi
phân tử kháng thể cần quá trình gấp chính xác
của hai cầu disunfide để có thể thực hiện chức
năng li n kết kháng nguyên của nó
(Glockshuber et al., 1992). Vì vậy, sự biểu
hiện dung hợp cùng Trx, MBP, GST… sẽ
giúp cải thiện khả năng t n cũng như năng
xuất của protein ngoại lai khi sản xuất trong tế
bào E. coli (LaVallie & McCoy, 1995). Paola
Jurado et al. (2006) cũng đã nghi n cứu và
cho thấy vai trò cải thiện khả năng t n của
kháng thể tái tổ hợp sản xuất trong tế bào chất
của E. coli khi dung hợp cùng Trx. (Jurado et
al., 2006).
mimicking HER2 as
Immunogenicity and efficacy. Vaccine,
27(35): 4826–4833.
a
vaccine:
Chester K., Pedley B., Tolner B., Violet J.,
Antibodies for Clinical Applications in
Cancer. Tumor Biol., 25(1–2): 91–98.
Glockshuber R., Schmidt T., Pluckthun A.,
1992. The disulfide bonds in antibody
variable domains: effects on stability,
folding in vitro, and functional expression
in Escherichia coli. Biochemistry, 31(5):
1270–1279.
ng Thị Ngọc Hà, Nguyễn Thị Trung, Lê
Thị Thu Hồng, ỗ Thị Huyền, Trương
Nam Hải, 2017. Nghiên cứu lựa chọn điều
kiện biểu hiện kháng thể đơn chuỗi tái tổ
hợp nhận biết kháng nguyên nhóm máu A
trong chủng Escherichia coli. Tạp chí Sinh
học, 39(2): 191–198.
KẾT LUẬN
Protein antiA-scFv trong thiết kế dung
hợp Trx/antiA-scFv được biểu hiện thành
công ở dạng tan trong chủng JM109 trong môi
trư ng LBA, cảm ứng 0,1 mM IPTG khi
OD600 đạt khoảng 0,4 và nuôi cảm ứng ở
20oC, thu mẫu sau 16 gi nuôi cấy. Kết quả
này là cơ sở cho nghiên cứu tối ưu biểu hiện
protein dung hợp cho tinh chế và xác định
hoạt tính của kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp
antiA-scFv.
Joseph B. C., Pichaimuthu S., Srimeenakshi
S., 2015. An overview of the parameters
for recombinant protein expression in
Escherichia coli. Cell Sci. Ther., 6(5):
1–7.
Jurado P., de Lorenzo V., Fernandez L. A.,
2006. Thioredoxin fusions increase
folding of single chain Fv antibodies in
the cytoplasm of Escherichia coli:
evidence that chaperone activity is the
prime effect of thioredoxin. J. Mol. Biol.,
357(1): 49–61.
Lời cảm ơn: Công trình được hỗ trợ về kinh
phí củ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt N m “Nghi n cứu tạo kháng
thể đơn chuỗi tái tổ hợp nhận biết đ c hiệu
kháng nguy n nhóm máu”, mã số
VAST02.03/15-16 và trang thiết bị của Phòng
thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen.
Laemmli U. K., 1970. Cleavage of structural
proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 227: 680–685.
51
Dang Thi Ngoc Ha et al.
LaVallie E. R., McCoy J. M., 1995. Gene
Studier F. W., 2005. Protein production by auto-
induction in high-density shaking cultures.
Protein Expr. Purif., 41(1): 207–234.
fusion
Escherichia
expression
systems
Curr.
in
Opin.
coli.
Biotechnol., 6(5): 501–506.
Studier F. W., Rosenberg A. H., Dunn J. J.,
Dubendorff J. W., 1990. Use of T7 RNA
polymerase to direct expression of cloned
genes. Methods Enzymol., 185: 60–89.
Nakamura H., Nakamura K., Yodoi J., 1997.
Redox regulation of cellular activation.
Annu. Rev. Immunol., 15: 351–369.
Sambrook J., W Russell D., 2001. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harb. Lab. Press. Cold Spring
Harb. NY. 999
Ye T., Lin Z., Lei H., 2008. High-level
expression and characterization of an anti-
VEGF165 single-chain variable fragment
(scFv) by small ubiquitin-related modifier
fusion in Escherichia coli. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 81(2): 311–317.
Song H. N., Jang J. H., Kim Y. W., Kim D.
H., Park S. G., Lee M. K., Paek S. H.,
Woo E. J., 2014. Refolded scFv antibody
fragment against myoglobin shows rapid
reaction kinetics. Int. J. Mol. Sci., 15(12):
23658–23671.
Yuan R., Chen X., Chen Y., Gu T., Xi H.,
Preparation and diagnostic use of a novel
recombinant single-chain antibody against
rabies virus glycoprotein. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 98(4): 1547–1555.
Spadiut O., Capone S., Krainer F., Glieder A.,
Herwig C., 2014. Microbials for the
production of monoclonal antibodies and
antibody fragments. Trends Biotechnol.,
32(1): 54–60.
52
8 trang
15/01/2024
9200
Free
Bạn đang xem tài liệu "Biểu hiện dung hợp gen mã hóa kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp nhận biết kháng nguyên nhóm máu với Thioredoxin trong tế bào Escherichia Coli", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- bieu_hien_dung_hop_gen_ma_hoa_khang_the_don_chuoi_tai_to_hop.pdf
