Bài giảng Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Fish
Kthuậlahuỳnh quang tạchỗ Fish
❖ Là kĩ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định
vị các tế bào vi khuẩn.
❖ Nhận ra các dạng vsv quen thuộc, đã biết môi trường
nuôi cấy đặc hiệu.
❖ Xác định các vsv lạ, chưa biết rõ điều kiện & môi
trường nuôi cấy.
❖ Hệ thống phức tạp của các quần thể sinh vật.
❖ Kết hợp chính xác kĩ thuật di truyền phân tử .
❖ Hình dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi
trường tự nhiên hay trong các mô bệnh.
Kthuậlahuỳnh quang tạchỗ Fish
❖Mô tả quần thể vsv trong môi trường tự nhiên ( nổi
bật trần tích Wadden, vịnh na-uy……).
❖Trong y học: xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ
vi khuẩn (hô hấp, tiêu hóa,….).
❖Chuẩn đoán sự bất thường về cấu trúc và số lượng
NST ( trước và sau sinh) của thai nhi.
Quy trình thựhiện
• Dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic
của các loài vsv bằng cách dùng đầu dò được
đánh dấu huỳnh quang lai đặc biệt với các
trình tự đặc hiểu bổ sung với nó bên trong tế
bào nguyên vẹn ( không cần phá vỡ tế bào)
Quy trình gồm cábước cơ bản
• Chuẩn bị mẫu và đầu dò.
• Cố định mẫu.
• Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm
trong tế bào.
• Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai.
• Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng
đầu dò phát huỳnh quang
• trực tiếp).
• Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả.
Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang
• Đầu dò: Là những
olionucleotide dài
từ 15 đến 30 bp,
có trình tự bổ
sung với các
rRNA 16S của tế
bào vi sinh vật
➢Gần đây các trình tự đích khác như rRNA
23s,rRNA 18s hay mRNA cũng đã được xác
định thành công bởi thí nghiệm Fish.
➢rRNA 16 S được sử dụng vì ổn định về mặt di
truyền, số lượng bản sao nhiều và cấu trúc dc
bán bảo toàn
➢đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận biết và
định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng
và chính xác.
Đánh dấu huỳnh quang lên đầu dò
có 2 cách:
• Trực tiếp: đánh dấu chất nhuộm huỳnh quang
lên đầu dò, không cần bước dò tìm sau quá
trình lai
• Gián tiếp: đánh dấu bằng một số hợp chất chỉ
thị trung gian, đồng thời phải tiến hành dò tìm
sau quá trình lai
Chất chỉ thị Dioxygenin (DIG)
Enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu
Đầu dò polyribonucleotide
Trực tiếp: thuốc nhuộm huỳnh quang
• Đặc điểm quang trọng: các chất huỳnh quang
có mức năng lượng kích thích và phát xạ khác
nhau
-> cho phép phát hiện đồng thời 2 hay nhiều vsv
khi chỉ lai 1 lần duy nhất
Quy trình thực hiện
B1:Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ
• Mục đích: đưa được số lượng lớn các đầu dò thấm
ngược vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng trình tự
đích RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế
bào và hình thái của chúng.
• Hình thức: ngâm mẫu trong các hợp chất tạo tủa
ethanol hoặc methanol
• Yêu cầu: kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu
huỳnh quang với trình tự đích bổ sung với chúng
với số lượng lớn nhất
B2: Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu
1. Xử lý bề mặt kính: phủ lớp chất tráng kính ngoài
(gelatin/poly-L-lysine/các hc tạo muối)
2. Các tế bào sau giai đoạn xử lý cố định vào mặt
kính
3. Điều kiện: môi trường tối ẩm,
T°:27->50°C,
thời gian lai: 30 phút -> vài giờ
4. Rửa bằng nước cất 2 lần
5. Sấy, cố định các p.tử lai ( có thể bổ sung các chất
chống phai màu)
B3: quan sát và xử lý tín hiệu
• Kính hiển vi có trang bị dải
lọc nhiều tần ( hoặc kính
hiển vi laze quét đồng
tiêu)
• Máy ảnh CCD
• Phần mềm xử lý ảnh kĩ
thuật số
Nhược điểm kỹ thuật Fish
Các chất tự phát huỳnh quang
Kếqukhông chính xác
Đầu dò thiếu tính đặc hiệu
Số lượng đầu dò quá ít
Cấu trúc của đầu dò hay trình
tự đích quá phức tạp
Không thu được kếquả
Hàm lượng RNA quá thấp
Ảnh chụp bị mất màu
Ứng dụng của Fish
❖Fish được sử dụng trên toàn thế giới để nghên
cứu các quần thể vi khuẩn trong tự nhiên như
môi trường dưới nước,trong đất hay trên bề
mặt rễ thực vật.
Vd: Khi sử dụng fish để phát hiện sự nổi trội
chủng Bacillus trong đất đồng cỏ tại Hà Lan.
Loại vi khuẩn có hình que, có chứa ribotype
DA001 16S rRNA.
❖ Vi khuẩn cộng sinh
Sử dụng rRNA 16S để định danh và phân cấp
phát sinh loài. Dùng FISH để chứng minh tính
chất cộng sinh của vi khuẩn.
❖Hệ vi sinh vật trong nước thải
Fish sử dụng các đầu dò oligonnucleotide được
tạo ra bằng những kĩ thuật phân tử PCR để
nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong nướn
thải, bùn hoạt tính.
Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế
bào Candida albicans(Moter et al., 2000)
Sự đdạng củvsv
Tải về để xem bản đầy đủ
29 trang
23040
Free
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ Fish", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- bai_giang_ki_thuat_lai_huynh_quang_tai_cho_fish.pptx
