Ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong kiểm soát chất lượng thực phẩm bổ sung Amino Axit mạch nhánh
Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ
Ứng dꢀng phương pháp điện di mao quản
trong kiểm soát chất lưꢁng
thực phẩm bổ sung amino axit mạch nhánh
Nguyễn Thanh Đàm, Vũ Minh Tuấn, Nguyễn Mạnh Huy,
Dương Hồng Anh, Phạm Hùng Việt*
Phòng thí nghiệm trọng điꢀm về Công nghệ phân tích phꢁc vꢁ Kiꢀm đꢂnh môi trường và An toàn thực phẩm,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Ngày nhận bài 28/6/2018; ngày chuyển phản biện 3/7/2018; ngày nhận phản biện 30/7/2018; ngày chấp nhận đăng 6/8/2018
Tóm tắt:
Các amino axit mạch nhánh (BCAA) gồm L-valine (Val), L-leucine (Leu) và L-isoleucine (Ile) là những amino axit
thiết yếu, đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển cơ bắp nên thường đưꢁc bổ sung trong các loại thực phẩm
dùng cho vận động viên, người tập thể hình. Nghiên cứu này trình bày việc ứng dꢀng phương pháp điện di mao
quản sꢂ dꢀng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) kết hꢁp với thiết kế thí nghiệm theo phương pháp mặt
mꢀc tiêu sꢂ dꢀng mô hình lặp tâm (RSM-CCD) nhằm tối ưu hóa quy trình phân tích các BCAA trong thực phẩm
bổ sung. Các điều kiện tối ưu đưꢁc xác định bao gồm dung dịch điện ly nền (BGE) là dung dịch axit citric 1,11M, bổ
sung polyethylene glycol (PEG) 2,32%, điện thế tách -16,9 kV và thời gian bơm mẫu 45 giây. Quá trình thẩm định
quy trình đưꢁc thực hiện thông qua việc xác định một loạt các thông số về giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định
lưꢁng (LOQ), hệ số tương quan đường chuẩn (R2), độ đúng và độ chꢀm. Quy trình sau đó đã đưꢁc áp dꢀng để phân
tích 4 mẫu thật, kết quả cho thấy sự phù hꢁp tương đối tốt giữa hàm lưꢁng BCAA đo đưꢁc bằng CE-C4D với thông
tin đưa ra từ nhà sản xuất.
Từ khóa: amino axit mạch nhánh, dinh dưỡng thể chất, điện di mao quản, kế hoạch hóa thực nghiệm.
Chỉ số phân loại: 2.4
mặt hàng này. Việc xác minh hàng giả, hàng nhái, ngoài
các biện pháp quản lý còn có thể được thực hiện thông
qua xác định hàm lượng của các thành phần chính trong
(Val), L-leucine (Leu) và L-isoleucine (Ile) là các amino
sản phẩm (như hàm lượng của Val, Leu và Ile). Tuy vậy,
axit thiết yếu của cơ thể, thường được sử dụng nhiều trong
hiện nay trong nước chưa có các công bố về xác định hàm
sản xuất dược phẩm [1]. Trong lĩnh vực thực phẩm, các
lượng các BCAA trong thực phẩm.
Đꢀt vꢁn đꢂ
Các amino axit mạch nhánh (BCAA) bao gồm L-valine
BCAA được sử dụng rộng rãi trong đồ uống thể thao và
Trên thế giới đã có một số nghiên cứu xác định hàm
lượng của các amino axit trong thực phẩm nói chung và
thực phẩm bổ sung nói riêng. Omar và cộng sự (2017)
đã dùng thiết bị điện di mao quản (CE) kết hợp detector
UV (CE-UV) để xác định 6 amino axit tự do (alanine,
asparagine, glutamine, proline, serine và valine) trong
thực phẩm với khoảng tuyến tính 2,5-40 mg/l [3]. Shigeki
Akamatsu và cộng sự (2013) đã phân tích đồng thời
16 amino axit tự do (bao gồm valine, tổng leucine và
isoleucine) trong thực phẩm chức năng sữa ong chúa với
thực phẩm dinh dưỡng, bao gồm thực phẩm bổ sung dùng
cho các vận động viên [2]. Trong thời gian gần đây, tại
nước ta, xu hướng tập thể hình nhằm nâng cao sức khoẻ
và cải thiện vóc dáng đang rất phát triển, đặc biệt là trong
giới trẻ. Với những lợi ích trong việc duy trì và xây dựng
cơ bắp, các loại thực phẩm bổ sung BCAA cũng rất được
ưu chuộng bởi những người tập thể hình. Rất nhiều sản
phẩm bổ sung BCAA có mặt trên thị trường, bao gồm
dạng viên nén, viên nang, dạng bột… Cùng với sự phát
triển của thị trường tiêu thụ, các loại hàng giả, hàng nhái
cũng bắt đầu xuất hiện. Bên cạnh đó, năng lực của người LOD từ 0,61-10,5 µg/g bằng CE ghép nối khối phổ (CE-
tiêu dùng trong nước chưa thật sự cao, công tác quản lý thị MS) [4]. Dazhong Shen và cộng sự (2013) đã sử dụng CE
trường chưa thật sự tốt. Thực trạng này đặt ra yêu cầu cần kết hợp detector độ dẫn không tiếp xúc cộng hưởng vi
thiết phải có các biện pháp nhằm kiểm soát chất lượng của phân (CE-DRC4D) để phân tích 10 amino axit (bao gồm
*Tác giả liên hệ: Email: [email protected]
60(10) 10.2018
34
Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ
valine và leucine) với LOD từ 0,1-0,4 µM [5]. Trong các
nghiên cứu trên, chỉ nghiên cứu của Akamatsu bao gồm cả
3 amino axit mạch ngắn, trong đó không phân biệt leucine
và isoleucine, kết quả đưa ra dưới dạng hàm lượng tổng
của 2 amino axit này. Để tách biệt leucine và isoleucine,
Ting Wang và cộng sự (2015) đã thực hiện dẫn xuất hoá
bằng n-propyl clorofomat sử dụng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ 2 lần (HPLC-MS/
MS) [6]. Đây là biện pháp tốn kém và khó thực hiện, yêu
cầu trang thiết bị đắt tiền cũng như kỹ thuật cao.
Application of capillary
electrophoresis in quality
control of branched-chain
amino acid supplements
Thanh Dam Nguyen, Minh Tuan Vu,
Manh Huy Nguyen, Hong Anh Duong, Hung Viet Pham*
Bên cạnh các phương pháp sắc ký truyền thống vốn
có chi phí cao, CE với các ưu điểm như “xanh” hơn (ít sử
dụng các dung môi hữu cơ độc hại), chi phí thấp hơn là
một phương pháp nhiều tiềm năng trong phân tích thực
phẩm nói chung và kiểm soát chất lượng thực phẩm bổ
sung BCAA nói riêng. Ứng dụng CE trong phân tích hàm
lượng các BCAA, thông qua đó kiểm soát chất lượng mặt
hàng thực phẩm bổ sung BCAA là một hướng đi mới, thiết
thực và khả thi. Bài báo này trình bày những kết quả đạt
được khi sử dụng CE-C4D kết hợp với kế hoạch hóa thực
nghiệm theo phương pháp mặt mục tiêu sử dụng mô hình
lặp tâm (RSM-CCD) để phát triển quy trình phân tích
kiểm định hàm lượng BCAA trong thực phẩm bổ sung.
VNU Key Laboratory of Analytical Technology for Environmental
Quality and Food Safety Control (KLATEFOS), VNU University of
Science, Vietnam National University (VNU), Hanoi
Received 28 June 2018; accepted 6 August 2018
Abstract:
Branched-chain amino acids (BCAAs) including
L-valine (Val), L-leucine (Leu) and L-isoleucine (Ile)
are essential amino acids, which play an important
role in muscle development, and are often added in
food for athletes or bodybuilders. This study presents
the application of capillary electrophoresis using a
contactless conductivity detector (CE-C4D) combined
with the experimental design using the response surface
methodology with central composite design (RSM-CCD)
to optimize the analytical process of BCAAs in food
supplements. The optimum conditions to be determined
include the background electrolyte (BGE) as 1.11M
citric acid solution added with 2.32% of PEG (m/v),
-16.9 kV of applied voltage, and 45 seconds of injection
time. Method validation is performed by defining limit of
detection (LOD), limit of quantitation (LOQ), linearity
(R2), trueness, and precision. The procedure was used to
analyse four of real samples, which showed a quite good
fit between the BCAAs content measured with CE-C4D
and the information provided by the manufacturers.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Hóa chất
Tất cả các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều có
độ tinh khiết phân tích và được đặt mua từ Sigma-Aldrich,
Đức hoặc Tokyo Chemiscal Industry, Nhật Bản, ngoại trừ
axit lactic (Lac) từ Guangdong, Trung Quốc. Dung dịch
chuẩn gốc riêng lẻ nồng độ 1000 mg/l của L-Valine (Val),
L-Leucine (Leu) và L-Isoleucine (Ile) được sử dụng để
pha chế các dung dịch chuẩn hỗn hợp các chất phân tích.
Các hóa chất được sử dụng để chuẩn bị các dung dịch điện
ly nền (BGE) bao gồm: axit acetic, axit lactic, axit citric,
axit succinic và polyethylene glycol (PEG) 10000.
Keywords: branched-chain amino acids, capillary
electrophoresis, design of experiments, physical
nutrition.
Thiết bị
Hệ điện di mao quản một kênh vận hành bằng tay được
sử dụng trong tất cả các thí nghiệm. Thiết bị này bao gồm
một nguồn cao thế ±30 kV (Spellman, Anh), bộ ghi dữ liệu
e-corder (eDAQ, Úc) và detector C4D (eDAQ, Úc). Mao
quản sử dụng trên thiết bị là mao quản silica nóng chảy
(BGB Analytik AG, Switzerland) có đường kính trong 25
µm, chiều dài tổng 60 cm và chiều dài hiệu dụng là 49
cm. Trước khi sử dụng lần đầu hoặc khi có sự thay đổi
về BGE, mao quản được xử lý bằng cách đẩy dung dịch
NaOH 1M đi qua trong 10 phút, sau đó tới nước deion và
cuối cùng là dung dịch BGE. Nước deion được tạo ra từ
thiết bị Simplicity UV (Millipore, USA) được sử dụng để
pha chế mọi dung dịch và pha loãng mẫu.
Classification number: 2.4
35
60(10) 10.2018
Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ
Lấy mẫu và xử lý mẫu
(-14÷-18 kV) và thời gian bơm mẫu (40÷60 giây); mỗi
yếu tố được chia làm 5 mức độ (-2, -1, 0, +1, và +2). Theo
đó, có tất cả 30 thí nghiệm cần tiến hành, bao gồm 16 thí
nghiệm thuộc thiết kế yếu tố toàn phần, 8 thí nghiệm ở
trục và 6 thí nghiệm ở tâm. Hàm mục tiêu được lựa chọn
là độ phân giải giữa hai peak Ile và Leu với kỳ vọng độ
phân giải càng lớn càng tốt. Bên cạnh đó, thời gian phân
tích (tính theo thời gian xuất hiện của peak cuối cùng,
Leu) cũng được sử dụng như một hàm mục tiêu thứ hai
(tầm quan trọng thấp hơn) với yêu cầu thời gian di chuyển
của Leu nằm trong khoảng 900-1200 giây.
Trong nghiên cứu này, 4 sản phẩm thực phẩm bổ sung
BCAA dạng bột đã được thu thập từ các cửa hàng chuyên
cung cấp các sản phẩm cho người tập gym trên địa bàn
thành phố Hà Nội. Các sản phẩm được ký hiệu như sau:
M1 (Xtend BCAA 30 servings), M2 (Xtend Go BCAA 30
servings), M3 (On-Gold Standard BCAA 30 servings) và
M4 (USN BCAA 30 servings). Từ mỗi sản phẩm này, lấy
chính xác 0,5 gam mẫu, chuyển vào bình định mức 50 ml,
thêm nước deion đến vạch và lắc kỹ. Pha loãng (125 lần)
dung dịch thu được này với nước deion và lọc qua màng
lọc có kích thước lỗ 0,2 µm. Sau đó, 1 ml dung dịch sau
khi lọc được sử dụng để bơm vào hệ CE-C4D. Để tránh sai
số có thể mắc phải do sự trộn lẫn không đồng đều của sản
phẩm (khối lượng cả sản phẩm khá lớn, còn khối lượng
lấy mẫu tương đối nhỏ), mỗi sản phẩm được lấy mẫu 3
lần, mỗi lần được phân tích lặp 3 lần, kết quả thu được là
giá trị trung bình giữa các lần lặp khác nhau. Dung dịch
sau khi hòa tan (nhưng chưa pha loãng) của lần lấy mẫu
đầu tiên đối với mỗi sản phẩm (ký hiệu là M1.1, M2.1,
M3.1 và M4.1 tương ứng) được phân tích đồng thời bằng
phương pháp CE-C4D và HPLC-DAD.
Kết quả thu được từ mô hình được đánh giá thông qua
p-value hoặc F-value đối với các kiểm định F-test và Lack
of fit test, đồng thời giá trị của các hàm mục tiêu tại điều
kiện phân tích tối ưu mà mô hình dự đoán cũng được kiểm
tra để đảm bảo sự dự đoán của mô hình là phù hợp với
thực tế.
Thẩm định phương pháp
Phương pháp phân tích được đánh giá thông qua một
loạt các thông số: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định
lượng (LOQ), độ tuyến tính (R2), khoảng tuyến tính, độ
đúng và độ chụm. Độ tuyến tính và khoảng tuyến tính
được đánh giá thông qua đường chuẩn thu được khi phân
tích lặp lại ba lần đối với ba chất phân tích ở 5 mức nồng
độ 5; 10; 15; 20 và 25 mg/l. Độ chụm được xác định bằng
độ lặp lại (trong ngày) và độ tái lặp (giữa các ngày khác
nhau) dưới dạng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện
tích peak và thời gian di chuyển. Độ lặp lại (n=10) thu
được từ kết quả phân tích trong một ngày dưới các điều
kiện tối ưu, sử dụng dung dịch chuẩn nồng độ 10 mg/l
của mỗi chất phân tích. Độ tái lặp được xác định với cùng
dung dịch nhưng được thực hiện trong 10 ngày liên tiếp.
Độ đúng được xác định thông qua hiệu suất thu hồi (trên
nền nước deion và nền mẫu thật) ở hai mức nồng độ 7,5
và 17,5 mg/l, đồng thời so sánh kết quả phân tích của một
số mẫu trên CE-C4D với phương pháp HPLC-DAD. Các
mẫu này được chuẩn bị như đã đề cập trong phần xử lý
mẫu.
Khảo sát điều kiện phân tích ban đầu
Trước khi tiến hành tối ưu hóa bằng mô hình RSM-
CCD, các khảo sát ban đầu được thực hiện bằng cách tối
ưu từng nhân tố đơn lẻ nhằm xác định điểm ở tâm của mô
hình cũng như khoảng biến thiên của các yếu tố cho phù
hợp. Các điều kiện được khảo sát bao gồm: thành phần
của BGE, nồng độ BGE, điện thế tách và thời gian bơm
mẫu. Đối với thành phần BGE, 3 dung dịch axit ở hai
nồng độ 0,5M và 1,0M đã được khảo sát, bao gồm: axit
lactic, axit succinic và axit citric, mỗi dung dịch axit được
bổ sung PEG nồng độ 2% (m/v) nhằm loại bỏ tương tác
của nhóm silanol (-Si-OH) trên thành trong của mao quản
với các amino axit.
Sau khi lựa chọn được thành phần BGE phù hợp, các
yếu tố nồng độ axit (0,1÷1,5M), nồng độ chất bổ trợ PEG
(1÷4%), điện thế tách (-12÷-18 kV) và thời gian bơm mẫu
(10÷60 giây) được khảo sát lần lượt nhằm tìm ra điều kiện
phân tích tối ưu ban đầu. Các thông số được sử dụng để
đánh giá các điều kiện phân tích bao gồm diện tích các
peak và độ phân giải giữa hai peak cạnh nhau là Ile và
Leu.
Kết quả và bàn luận
Kết quả khảo sát điều kiện phân tích ban đầu
Kꢃt quả khảo sát thành phần BGE:
Trong dung dịch trung tính, các BCAA (có điểm đꢀng
điện pI~6,0) tồn tại chủ yếu dưới dạng muối nội không
mang điện. Để có thể phân tích được bằng CE-C4D, điều
kiện tiên quyết là cần chuyển các BCAA này về dưới dạng
cation (pH<pKa1~2,4) hoặc dạng anion (pH>pKa2~9,6).
Tối ưu hóa điều kiện phân tích dựa trên RSM-CCD
Điều kiện phân tích tối ưu được xác định một cách
chính xác hơn bằng cách sử dụng mô hình RSM-CCD với
điểm ở tâm là điều kiện ban đầu đã tìm được. Mô hình
xem xét sự ảnh hưởng của bốn yếu tố ảnh hưởng: nồng Tuy nhiên, việc phân tích trong điều kiện pH cao sẽ gặp
độ BGE (0,5÷1,5M), nồng độ PEG (1÷3%), điện thế tách nhiều khó khăn do dòng điện di thẩm thấu (EOF) khá lớn,
60(10) 10.2018
36
Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ
làm cản trở sự di chuyển của các anion cần phân tích. Vì
vậy, trong nghiên cứu này, các BGE có môi trường axit
được sử dụng, bao gồm axit lactic, axit succinic và axit
citric, trong đó mỗi loại BGE được khảo sát ở hai nồng độ
0,5M và 1,0M. Để hạn chế tương tác của các amino axit
với nhóm silanol (-Si-OH) trên bề mặt thành mao quản,
mỗi dung dịch axit được bổ sung PEG nồng độ 2% (m/v).
Các điều kiện phân tích khác được giữ cố định, bao gồm:
điện thế tách -15 kV, thời gian bơm mẫu 30 giây.
Hình 2. Kết quả khảo sꢀt ảnh hưởng nồng độ BGE tới diện tích
peak và độ phân giải. Ký hiệu trong hình: S_Val, S_Ile, S_Leu
lần lượt là diện tích của các peak Valine, Isoleucine và Leucine;
Rs_Ile/Leu là độ phân giải giữa hai peak Isoleucine và Leucine.
Kꢃt quả khảo sát nồng độ PEG:
Các amino axit nói chung và các BCAA nói riêng có
khả năng tạo liên kết hydro với nhóm -Si-OH tự do ở
thành trong của mao quản, làm cản trở khả năng tách chất
trong CE. Nghiên cứu này sử dụng PEG nhằm loại bỏ ảnh
hưởng nêu trên của nhóm silanol. Nồng độ PEG (m/v)
được khảo sát trong khoảng 1-4 %, các điều kiện phân
tích khác được giữ không đổi như trong khảo sát nồng
độ BGE. Kết quả trên hình 3 cho thấy, nồng độ PEG ảnh
hưởng tới cả độ lớn của diện tích peak lẫn độ phân giải
giữa Ile/Leu. Diện tích peak của cả ba chất đều tăng khi
tăng nồng độ PEG từ 1% lên 2%, sau đó giảm dần khi
tiếp tục tăng PEG. Xu hướng này cũng diễn ra đối với độ
Hình 1. Điện di đồ khảo sꢀt ảnh hưởng của thành phần BGE tới
sự phân tꢀch của cꢀc chất phân tích.
Kết quả thu được cho thấy, việc sử dụng các BGE có
môi trường axit là thích hợp khi tất cả các dung dịch axit
được khảo sát đều cho tín hiệu của cả ba đối tượng phân
tích (hình 1). BGE với thành phần axit lactic cho diện tích
peak lớn nhất nhưng độ phân giải giữa hai peak Ile và Leu
lại nhỏ nhất. Trong hai axit còn lại, axit citric cho độ phân
giải giữa Ile/Leu lớn hơn ở cả hai nồng độ, do đó, axit
citric được lựa chọn làm BGE để phân tích các BCAA.
Kꢃt quả khảo sát nồng độ BGE:
Nồng độ axit citric trong BGE sau đó được tiến hành
khảo sát trong khoảng 0,1-1,5M nhằm xác định nồng độ
BGE thích hợp nhất. Các điều kiện khác được giữ cố định
như trong thí nghiệm khảo sát về thành phần BGE. Hình
2 thể hiện sự biến đổi diện tích peak của các chất phân
tích và độ phân giải giữa Ile/Leu khi thay đổi nồng độ axit
citric. Ở nồng độ citric cao hơn, sự tách chất diễn ra tốt
hơn và độ phân giải giữa Ile/Leu tăng lên, mặc dù sự thay
đổi này là không lớn. Ngược lại, khi tăng nồng độ axit
citric, diện tích peak có xu hướng giảm dần và giảm khá
nhanh khi nồng độ thay đổi từ 1,0M tới 1,5M. Lý do của
sự biến đổi này là bởi ở nồng độ lớn, độ dẫn của BGE cao,
làm cho sự chênh lệch tín hiệu giữa chất phân tích và nền
giảm xuống. Vì vậy, nồng độ 1,0M của axit citric được lựa
chọn là điều kiện thích hợp vì ở điều kiện này, cả diện tích
peak (4 mV.s) và độ phân giải đều khá tốt (1,4) khi so với
các điều kiện còn lại.
Hình 3. Kết quả khảo sꢀt ảnh hưởng của nồng độ PEG tới diện
tích peak và độ phân giải. Ký hiệu trong hình: S_Val, S_Ile, S_Leu
lần lượt là diện tích của các peak Valine, Isoleucine và Leucine;
Rs_Ile/Leu là độ phân giải giữa hai peak Isoleucine và Leucine.
37
60(10) 10.2018
Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ
phân giải giữa Ile/Leu. Bên cạnh đó, sự có mặt của PEG tính. Giữa thời gian bơm mẫu 50 giây và 60 giây, sự thay
còn làm tăng độ nhớt của BGE và làm giảm cường độ của
dòng EOF, dẫn đến thời gian di chuyển của các chất phân
tích tăng lên. Tương tự với thí nghiệm khảo sát nồng độ
axit citric, điều kiện PEG 2% được lựa chọn do đáp ứng
được cả về diện tích peak và độ phân giải, đồng thời thời
gian phân tích không quá dài.
đổi về diện tích các peak cũng như độ phân giải giữa Ile/
Leu không nhiều, cho thấy lượng mẫu được bơm vào mao
quản đã gần bão hòa. Vì vậy, giá trị 50 giây được lựa chọn
làm điều kiện thời gian bơm mẫu.
Kết quả từ kế hoạch hóa thực nghiệm
Sau khi xác định được điều kiện phân tích ban đầu,
việc tối ưu hóa được tiến hành bằng kế hoạch hóa thực
nghiệm với mô hình RSM-CCD nhằm đạt được điều kiện
phân tích chính xác hơn. Điều kiện phân tích được tìm
thấy ban đầu (BGE là axit citric 1,0M bổ sung PEG 2%,
điện thế tách -16 kV và thời gian bơm mẫu 50 giây) được
sử dụng làm tâm của mô hình. Đồng thời, qua các khảo sát
trên, khoảng biến đổi của các yếu tố ảnh hưởng cũng được
xác định: nồng độ axit citric (X1) 0,5÷1,5M; nồng độ PEG
(X2) 1,0÷3,0%; điện thế tách (X3) -14÷-18 kV và thời gian
bơm mẫu (X4) 40÷60 giây. Mục tiêu được lựa chọn là độ
phân giải giữa hai peak gần nhau Ile và Leu (Y1) với kỳ
vọng giá trị của Y1 càng lớn càng tốt. Ngoài ra, để đáp ứng
nhu cầu phân tích trong thực tế, thời gian phân tích không
nên quá dài (<20 phút, tương đương với 1200 giây). Mặt
khác, quá trình khảo sát ban đầu cũng cho thấy, thời gian
di chuyển của peak cuối cùng (Leu) thường lớn hơn 900
giây. Vì vậy, để đảm bảo độ chính xác cho mô hình, thời
gian di chuyển của Leu được lựa chọn làm mục tiêu thứ
hai (Y2) với kỳ vọng độ lớn của Y2 nằm trong khoảng 900-
1200 giây (bảng 1).
Kꢃt quả khảo sát điện thꢃ tách:
Điện thế tách và thời gian bơm mẫu là hai thông số
hoạt động của thiết bị đóng vai trò quan trọng đối với sự
phân tách chất trong CE và cần được khảo sát một cách
đầy đủ. Ở điện thế tách có độ lớn dưới 12 kV, thời gian
phân tích thường khá dài, trong khi đó, độ lớn điện thế
tách cao trên 18 kV có thể thiếu ổn định và gây ra nhiễu
nền lớn. Trong nghiên cứu này, điện thế tách được khảo
sát trong khoảng -12 kV tới -18 kV nhằm hạn chế những
ảnh hưởng trên, các điều kiện khác được giữ cố định.
Theo xu hướng chung, khi tăng điện thế tách, độ linh động
của các ion lớn hơn, chúng di chuyển nhanh hơn, kéo theo
đó là thời gian di chuyển ngắn hơn, diện tích peak giảm
xuống và độ phân giải tăng lên. Các sự biến đổi này có thể
thấy được trên hình 4. Mặc dù điện thế -18 kV có độ phân
giải lớn nhất giữa hai peak cạnh nhau là Ile và Leu, nhưng
điều kiện -16 kV được lựa chọn do có độ phân giải khá tốt
(1,4) đồng thời đường nền ổn định hơn.
Bảng 1. Cꢀc yếu tố ảnh hưởng trong mô hình và cꢀc mức nghiên
cứu tương ứng.
Mức nghiên cứu
Ký
hiệu
Đơn
vị
Yếu tố ảnh hưởng
-2 (-α)
0,5
1
-1
0
+1
+2 (+α)
1,5
Nồng độ axit citric
Nồng độ PEG
X1
X2
X3
X4
mol/l
%
0,75
1,5
-15
45
1
1,25
2,5
-17
55
2
3
Điện thế tách
kV
s
-14
40
-16
50
-18
60
Thời gian bơm mẫu
Hình 4. Kết quả khảo sꢀt ảnh hưởng của điện thế tꢀch tới diện
tích peak và độ phân giải. Ký hiệu trong hình: S_Val, S_Ile, S_Leu
lần lượt là diện tích của các peak Valine, Isoleucine và Leucine;
Rs_Ile/Leu là độ phân giải giữa hai peak Isoleucine và Leucine.
Mô hình dự đoán đối với các hàm mục tiêu đều có độ
tin cậy thống kê cao khi các giá trị p-value của mô hình
cho Y1 và Y2 đều nhỏ hơn 0,0001, đồng thời giá trị p-value
cho phép thử lack-of-fit đều lớn hơn 0,1. Kết quả cũng
cho thấy mối liên hệ giữa hàm mục tiêu và các yếu tố
ảnh hưởng là các phương trình tuyến tính bậc nhất, trong
đó, BGE có ảnh hưởng tới cả độ phân giải và thời gian di
chuyển (thể hiện thông qua sự có mặt của nồng độ axit
citric (X1) và nồng độ PEG (X2) trong phương trình). Các
sự ảnh hưởng này đều có tác động dương, khi tăng nồng
độ PEG thì độ phân giải và thời gian di chuyển cũng tăng
Kꢃt quả khảo sát thời gian bơm mẫu:
Thời gian bơm mẫu là yếu tố cuối cùng được khảo
sát và được thay đổi từ 10-60 giây. Khi tăng thời gian
bơm mẫu, lượng mẫu đi vào mao quản lớn hơn và diện
tích peak tăng lên, góp phần đạt được LOD tốt hơn. Tuy
nhiên, khi lượng chất phân tích lớn, quá trình khuyếch tán
trong dung dịch diễn ra nhanh hơn, chân peak thường dãn
rộng hơn và làm giảm độ phân giải cũng như tính tuyến lên. Ngược lại, tăng thời gian bơm mẫu (X4) sẽ làm giảm
60(10) 10.2018
38
Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ
độ phân giải (Y1), còn tăng độ lớn điện thế tách (X3) sẽ của phương pháp nằm trong khoảng từ 0,82÷1,2 mg/l, đáp
làm giảm thời gian di chuyển. Điều này là phù hợp với các ứng được yêu cầu kiểm soát chất lượng thực phẩm bổ
phân tích ở trên. Bên cạnh đó, điện thế tách không có mặt sung BCAA do hàm lượng các amino axit trong các mẫu
trong phương trình hàm mục tiêu của độ phân giải (Y1), thực tế đều rất cao, khoảng 100 mg/g - tương đương với
còn thời gian bơm mẫu có mặt trong phương trình của thời khoảng 8 mg/l sau khi xử lý mẫu. Đường chuẩn thu được
gian di chuyển (Y2). Sự không ảnh hưởng của thời gian dựa trên 5 điểm chuẩn trong khoảng 5÷25 mg/l với hệ số
bơm mẫu tới thời gian di chuyển là dễ hiểu, trong khi sự tương quan R2 khá tốt, lớn hơn 0,991. Phương pháp cũng
vắng mặt của điện thế tách trong phương trình của Y2 có cho thấy độ chụm tốt khi RSD đối với các thử nghiệm về
thể lý giải là do sự thay đổi điện thế tách gây ra sự thay độ lặp lại và độ tái lặp đều tốt, nhỏ hơn 8% đối với diện
đổi về cả khoảng cách giữa các peak lẫn độ rộng của từng tích peak và nhỏ hơn 3% đối với thời gian di chuyển.
peak. Sự ảnh hưởng đồng thời theo cùng một chiều hướng
Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua
này (tăng độ lớn của điện thế tách làm giảm khoảng cách
hiệu suất thu hồi (trên nền nước deion và nền mẫu thật)
peak cũng như thu hẹp chân peak) có thể dẫn tới sự ít thay
cũng như so sánh với các kết quả thu được khi phân
đổi của độ phân giải. Các phương trình của hàm mục tiêu
tích đối chứng cùng một dung dịch bằng phương pháp
được mô hình đưa ra như sau:
HPLC-DAD. Hiệu suất thu hồi trên cả hai nền mẫu đối
Y1=1,211+0,259X1+0,080X2–0,004X4
Y2=2347,7+335,5X1+38,1X2+95,2X3
với tất cả các chất phân tích đều tốt, nằm trong khoảng 90-
110%. Bên cạnh đó, kết quả đối chứng về hàm lượng các
BCAA trong 4 mẫu thực giữa hai phương pháp CE-C4D
và HPLC-DAD khá tốt khi độ lệch giữa hai phương pháp
chỉ nằm trong khoảng 10%, trừ nồng độ Val và Leu trong
mẫu M1.1 sai khác lần lượt là 11,2% và 13,8% (bảng 3).
Sự sai khác này là có thể chấp nhận được và cho thấy
phương pháp CE-C4D đã phát triển hoàn toàn có khả năng
thay thế HPLC-DAD với mục tiêu phân tích BCAA trong
thực phẩm bổ sung.
Từ các điều kiện trên, thu được các kết quả tối ưu từ
mô hình như sau: nồng độ axit citric 1,11M, nồng độ PEG
2,32%, điện thế tách -16,9 kV và thời gian bơm mẫu 45
giây.
Thẩm định quy trình phân tích
Sau khi xác định được các điều kiện phân tích tối ưu,
quy trình sẽ được thẩm định thông qua một loạt thông
số bao gồm: LOD, LOQ, khoảng đường chuẩn và hệ số
tuyến tính của đường chuẩn, độ lặp lại và độ tái lặp của
diện tích peak và thời gian di chuyển cũng như hiệu suất
thu hồi trên các nền mẫu khác nhau. Bảng 2 trình bày các
kết quả thu được khi đánh giá quy trình phân tích. LOD
Bảng 3. Kết quả đꢀnh giꢀ độ đúng của phương phꢀp thông qua
phân tích đối chứng bằng HPLC.
Hàm lưꢁng Val
đo đưꢁc (mg/l)
Hàm lưꢁng Ile đo đưꢁc
(mg/l)
Hàm lưꢁng Leu
đo đưꢁc (mg/l)
Mẫu
HPLC-
Sai
HPLC- Sai
CE-C4D
CE-
HPLC-
DAD
CE-C4D
Sai kháca
kháca
DAD
1272
1440
kháca
C4D
Bảng 2. Kết quả thẩm định quy trình phân tích qua cꢀc thông
số thống kê.
DAD
1341
1345
M1.1 1491
M2.1 1308
11,2
-2,8
1385
1285
8,9
2819
2465
2477
2521
13,8
-2,2
Chất phân tích
LOD (mg/l)
Val
Ile
Leu
0,82
2,7
-10,8
1,2
1,0
M3.1 1502
M4.1 1157
1387
1188
8,3
1392
1199
1453
1328
-4,2
-9,8
2684
2355
2866
2591
-6,4
-9,1
LOQ (mg/l)
4,1
3,4
-2,6
Khoảng đường chuẩn (mg/l)
R2
5÷25
0,996
5÷25
0,997
5÷25
0,991
a: tính theo công thức (giá trị đo được theo CE - giá trị đo được theo
HPLC)/giá trị đo được theo HPLC * 100 (%).
Kết quả phân tích mẫu thực (hình 5)
Độ lặp lại (10 mg/l, n=10)
RSDa (%)
Trong nghiên cứu này, 4 mẫu thực thuộc các nhãn hiệu
khác nhau đã được đặt mua từ các cửa hàng chuyên cung
cấp các sản phẩm thực phẩm bổ sung cho người tập thể
hình (bảng 4). Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng theo
công bố của nhà sản xuất khá phù hợp với giá trị đo được
trong thực tế bằng CE-C4D với sự sai khác nhỏ hơn 10%,
ngoại trừ hàm lượng Val trong mẫu M1 (16%) và mẫu
M2 (18%). Điều này cho thấy thông tin về hàm lượng
BCAA của các nhà cung cấp trong nghiên cứu tương đối
đáng tin cậy. Ngoài ra, mặc dù chưa thật sự rõ ràng nhưng
3,3
0,5
3,5
0,5
4,0
0,4
RSDb (%)
Độ tái lặp (10 mg/l, n=10)
RSDa (%)
7,4
5,6
6,8
RSDb (%)
1,8
2,1
1,6
H%
94÷99
91÷103
93÷102
RSDa: độ lệch chuẩn tương đối về diện tích peak; RSDb: độ lệch chuẩn
tương đối về thời gian di chuyển.
39
60(10) 10.2018
Khoa học Kỹ thuật và Công nghệ
dường như các nhà sản xuất có xu hướng bổ sung nhiều hành phân tích đối chứng bằng phương pháp HPLC. Các
kết quả thu được cho thấy phương pháp CE-C4D có độ tin
cậy tốt, thời gian phân tích tương đối ngắn mà không cần
quá trình xử lý mẫu bằng dẫn xuất hóa phức tạp. Dựa trên
những cơ sở này, phương pháp CE-C4D có thể được ứng
dụng nhằm góp phần kiểm soát chất lượng thực phẩm bổ
sung BCAA nói riêng và các loại thực phẩm bổ sung nói
chung trên thị trường.
BCAA hơn khi hàm lượng BCAA xác định được của 3/4
mẫu đều lớn hơn với hàm lượng ghi trên nhãn. Các kết
quả thu được này cũng khꢀng định khả năng ứng dụng
của phương pháp CE-C4D trong phân tích đối tượng thực
phẩm bổ sung.
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội thông qua đề tài
mã số TN.17.22. Các tác giả xin trân trọng cảm ơn.
TꢃI LIꢄꢅ ThaM KhẢo
[1] M.Y. Piñer, R. Bauza, L.Arce (2011), “Thirty years of capillary
electrophoresis in food analysis laboratories: Potential applications”,
Electrophoresis, 32(11), pp.1379-1393.
Hình 5. Điện di đồ phân tích mẫu chuẩn (15 mg/l) và 4 mẫu
thực.
[2] G. Bajotto, Y. Sato, et al. (2011), “Effect of BCAA
supplementation during unloading on regulatory components of
protein synthesis in atrophied soleus muscles”, European Journal of
Applied Physiology, 111, pp.1815-1828.
Bảng 4. Kết quả phân tích mẫu thật.
Hàm lưꢁng Val
Hàm lưꢁng Ile
Hàm lưꢁng Leu
[3] Mei Musa Ali Omar, Abdalla Ahmed Elbashir, Oliver
J. Schmitz (2017), “Capillary electrophoresis method with UV-
detection for analysis of free amino acids concentrations in food”,
Food Chemistry, 214, pp.300-307.
Ghi
Đo được
Đo được
Ghi
Đo được
Mẫu
Sai
Ghi trên
nhãna
Sai
Sai
trên
bằng CE-
bằng CE-
trên
bằng CE-
khácb
khácb
khácb
nhãna
C4Da
C4Da
nhãna
C4Da
M1
M2
M3
M4
1750
1750
1250
1250
2033±95
1905±96
1481±78
1216±59
16
1750
1750
1250
1250
1819±76
1843±92
1365±67
1199±95
3,9
5,3
9,2
-4,1
3500
3500
2500
2500
3778±166
3671±198
2681±86
7,9
4,9
7,2
0,5
[4] Shigeki Akamatsu, Takao Mitsuhashi (2013), “Development
of a simple analytical method using capillary electrophoresis-tandem
mass spectrometry for product identification and simultaneous
determination of free amino acids in dietary supplements containing
royal jelly”, Journal of Food Composition and Analysis, 30(1), pp.47-
51.
8,9
18
-2.7
2514±116
a: tính theo mg chất/1 liều dùng (khối lượng 1 liều dùng đối với từng mẫu:
M1: 13,26 gam; M2: 14,6 gam; M3: 10 gam; M4: 11 gam).
b: tính theo công thức (giá trị đo được theo CE - giá trị trên nhãn)/giá trị
trên nhãn * 100 (%).
[5]DazhongShen,YaolongLi, ZhenliZhang, PingZhang, QiKang
(2013), “Determination of amino acids by capillary electrophoresis
with differential resonant contactless conductivity detector”, Talanta,
104, pp.39-43.
Kết luận
Bằng phương pháp CE-C4D kết hợp với việc kế hoạch
hóa thực nghiệm theo mô hình RSM-CCD, nghiên cứu đã
xây dựng được quy trình phân tích đồng thời các BCAA
trong thực phẩm bổ sung. Quy trình đã được áp dụng
trong thực tế để kiểm tra chất lượng sản phẩm thực phẩm
[6] Ting Wang, Huiru Xie, Xu Chen, Xuehua Jiang, Ling Wang
(2015), “Simultaneous determination of leucine, isoleucine and
valine in Beagle dog plasma by HPLC-MS/MS and its application to
a pharmacokinetic study”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical
bổ sung BCAA hiện có trên thị trường, đồng thời tiến Analysis, 114, pp.426-432.
60(10) 10.2018
40
7 trang
13/01/2024
17800
Free
Bạn đang xem tài liệu "Ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong kiểm soát chất lượng thực phẩm bổ sung Amino Axit mạch nhánh", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- ung_dung_phuong_phap_dien_di_mao_quan_trong_kiem_soat_chat_l.pdf
